類香味細菌與巨大芽孢桿菌解離煤矸石應用研究

李夏夏，鐘 艷，謝承衛(wèi)

(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025)

煤矸石是煤炭生產過程中產生的一種固體廢棄物，大量堆放在露天空地，占用大量土地資源并對環(huán)境造成嚴重的污染[1-4]. 我國是世界上最大的煤炭生產和消費國，預計2020年，所占比例不低于60%，決定了煤炭資源在我國國民經濟及社會發(fā)展中的重要戰(zhàn)略地位[5]. 目前，煤矸石的主要用于生產矸石磚等，然而在實際應用中發(fā)現，由于煤矸石成份的復雜性，生產效益較低[6-7]. 因此，開發(fā)煤矸石的資源應用迫在眉睫，2010年，程勇等人[8-9]進行了煤矸石中炭的浮選及煤矸石活化的研究，將煤矸石中的炭資源化利用，進而增加煤矸石的綜合利用率. 如何開發(fā)出利用率高、污染小的煤矸石綜合利用技術，已成為當今研究熱點之一.

尋找高效的解磷微生物是該領域研究人員關注的焦點問題之一[10]，相關研究表明，芽孢桿菌和埃希氏菌對磷酸三鈣具有溶解能力，且分解能力存在較大差異[11-12]. Paul和Sundara[13]測定幾株芽孢桿菌溶解磷酸三鈣的效率高達19%，其中解磷能力最強的是巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，解磷微生物在礦物解離方面具有一定的應用價值. 本課題組率先將已報道的微生物細菌用于煤矸石的解離研究，獲得良好的效果，其中解鉀細菌、硅酸鹽細菌能有效解離煤矸石中所含礦物質，將其轉化為植物可吸收利用的營養(yǎng)元素，制備成煤矸石肥料[14]. 2015年，袁向芬等[15]發(fā)現解磷微生物巨大芽孢桿菌對高硫煤矸石具有解離作用，能將其中的營養(yǎng)物質釋放，使高硫煤矸石的資源化利用成為可能. 煤矸石富含豐富營養(yǎng)物質[16]，利用解磷微生物[17-18]解離煤矸石制備肥料，解離后煤矸石肥效顯著提升.

煤矸石是一種潛在的可利用資源，全國目前有數十億噸之多，未得到有效利用，開發(fā)新型的能有效解離煤矸石的微生物細菌，是煤矸石資源化、綠色化應用的重要基礎.

本研究通過廣泛的煤炭產區(qū)生態(tài)環(huán)境調研，從風化煤矸石中篩選、培育出具有高效解磷效果的微生物——類香味細菌，對類香味細菌菌株進行了生理生化，并與巨大芽孢桿菌進行了煤矸石解離的對比研究，類香味菌株對煤矸石的解離效果優(yōu)于傳統的菌株巨大芽孢桿菌. 類香味細菌的發(fā)現，進一步擴大了解磷微生物的范圍，目前類香味細菌在解磷方面的研究，還未見報道. 通過微生物解離煤矸石制備微生物復合肥料，是一種幾乎無污染、成本低、工藝簡單、利用率高的、新型的煤矸石應用方式. 本研究通過從風化煤矸石中篩選培養(yǎng)出高效解磷細菌，針對性強，解離煤矸石效果好，是一條尋找新型解離煤矸石微生物細菌的有效途徑.

1 實驗部分

1.1 實驗原料和菌株

1.1.1 試 樣

實驗原料取自貴州省六盤水地區(qū)某礦區(qū)煤矸石. 該煤矸石主要礦物成分為SiO252.40%, Al2O323.07%, Fe2O312.02%, CaO 3.4%, P2O50.27%, K2O 1.52%等.

1.1.2 菌種及其培養(yǎng)

本實驗所用菌株包括類香味菌(Myroides odoratimimus strain)以及巨大芽孢桿菌(bacillus megaterium). 類香味菌從風化煤矸石中提取、培育所得，研究發(fā)現該菌株具有高效的解磷能力，以及制備煤矸石肥料的潛力. 巨大芽孢桿菌(ACCC10011)來自于中國農業(yè)微生物菌種保藏中心，是一種公認的、常用的解磷微生物.

全營養(yǎng)固體培養(yǎng)基： 蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏1 g，酵母膏2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，體系pH調整為7.4.

類香味菌在全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)如圖1 所示： 菌落呈不透明，形狀邊緣規(guī)則，表面濕潤，中間呈現乳白，略帶淺黃色，有光澤，菌落約2 mm. 經革蘭氏染色鏡檢，菌體形態(tài)如圖2 所示，菌體呈革蘭氏陰性(G-)桿菌，有兩兩相連排列，無芽孢、鞭毛和莢膜.

圖1 類香味菌落形態(tài)Fig.1 The colonial morphology of Myroides odoratimimus strain

圖2 類香味菌體形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of Myroides odoratimimus strain

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液的制備

將培養(yǎng)好的類香味菌沖洗到三角瓶中，將菌液稀釋為菌株濃度在(1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL)，塞緊瓶塞，放入恒溫震蕩搖床上震蕩30 min，混勻待用.

1.2.2 單因素試驗方法

準確稱取一定量、不同粒度的煤矸石于培養(yǎng)皿中，加入不同濃度的菌液，攪拌均勻，用稀鹽酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調節(jié)不同pH值，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)若干天，取出烘干后，測定樣品中有效磷的含量，測定方法[19]參照《土壤分析技術》.

1.2.3 正交試驗

根據單因素實驗結果，對兩株細菌分別設計了L9(3)4正交實驗，尋找類香味菌株、巨大芽孢桿菌的最佳解離煤矸石條件.

2 結果與討論

2.1 菌株解離煤矸石單因素結果

2.1.1 體系pH值

煤矸石的粒度采用100目，接菌量濃度為1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL ，培養(yǎng)時間2 d，保持適當的干濕度，用稀鹽酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調節(jié)體系pH，測定pH對解磷效果的影響.

當將體系pH值調節(jié)為5，6，7，7.5，8，9，10，測定兩種菌株解離后煤矸石中有效磷的含量. 由圖3 可知，當體系pH值分別約7，9時，類香味菌和巨大芽孢桿菌解離煤矸石有效磷含量達到最大. 從變化趨勢可以看出，巨大芽孢桿菌對pH值變化比較敏感，波動較大，而類香味菌，隨著pH值變化，對解磷效果的影響較小，可以降低工藝上調節(jié)pH值的難度. 我國大多數土壤偏酸性或中性，使得類香味菌有較好的適應能力，利用類香味菌處理煤矸石制備肥料更有實際應用價值，能夠更好地改善土壤中缺磷的現象.

圖3 體系pH值對有效磷含量的影響Fig.3 Effective phosphorus change with the pH value of system

2.1.2 煤矸石顆粒大小

體系pH調整為8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL濃度的細菌，培養(yǎng)時間2 d，保持適當的干濕度，測定煤矸石粒度對解磷效果的影響.

圖4 煤矸石顆粒尺寸對有效磷含量的影響Fig.4 Effective phosphorus change with particle size of coal gangue

煤矸石顆粒大小不同時，測定兩種菌株解離后煤矸石中有效磷的含量. 由圖4 可知，煤矸石粒徑逐漸變小時，類香味菌株與巨大芽孢桿菌解離煤矸石的有效磷含量呈先增大后減小的趨勢，當顆粒尺寸分別為120目，40目時，有效磷含量達到最大. 但兩株菌株由于自身特性，對煤矸石不同顆粒尺寸的解磷效果并不相同，類香味菌株能夠在顆粒粒徑適中的情況下，使得菌液更加充分解離煤矸石中的磷，增加煤矸石中磷的利用率，而巨大芽孢桿菌屬于特別需氧型，顆粒尺寸減小使得煤矸石之間接觸緊密，導致其中的氧氣含量降低，抑制了該菌株的代謝作用. 但實際應用中，顆粒太大或太小都會對擴大生產過程產生一定的阻礙，這使得類香味菌株解離煤矸石具有更好的實際應用前景.

2.1.3 接菌量

煤矸石的粒度采用100目，培養(yǎng)時間2 d，體系pH調整為8，接入不同濃度的細菌，保持適當的干濕度，測定接菌量對解磷效果的影響. 向稱取一定量煤矸石的培養(yǎng)皿中分別加入一定濃度，體積分別為5，10，15，20，25，30，40，50 mL的菌液，混勻，將其放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 左右后，取出測定其有效磷含量，如圖5 所示.

圖5 接菌量對有效磷含量的影響Fig.5 Effective phosphorus change with the inoculation amount

由圖5 可知，對于類香味菌株而言，隨著接菌量的增大，有效磷含量逐漸增大，當接菌量為50 mL時，有效磷含量達到最大. 而巨大芽孢桿菌，隨著接菌量的變化，呈現先增大后減小的趨勢，當濃度為40 mL 時，有效磷含量最大. 當接菌量均為 40 mL 時，類香味菌解離煤矸石的能力強于巨大芽孢桿菌，能夠更高效地分解煤矸石中的難溶性的磷.

2.1.4 培養(yǎng)天數

煤矸石的粒度采用100目，體系pH調整為8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL 濃度的細菌，保持適當的干濕度，測定培養(yǎng)時間對解磷效果的影響. 當培養(yǎng)時間為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d時，測定兩株菌株分別解離煤矸石的有效磷含量. 由圖6 可知，培養(yǎng)天數為3 d時，類香味菌株解離煤矸石后有效磷含量達到最大； 培養(yǎng)時間為1 d時，巨大芽孢桿菌解離煤矸石后有效磷含量最高. 類香味菌株解離煤矸石的能力受時間因素影響較小，表明類香味細菌有很強的生命力，能將煤矸石中的大量無效磷轉化為有效磷. 而巨大芽孢桿菌，隨著培養(yǎng)天數的不同，解離能力不同程度降低，可能由于對氧有較強的依賴能力所影響，當氧含量多時，菌株活性越強，解離效果越好，而氧含量逐漸減少，會造成部分的巨大芽孢桿菌失去活性，從而使得有效磷含量較低，表明巨大芽孢桿菌處理煤矸石具有一定的不穩(wěn)定性，不能更高效地解離煤矸石中的無效磷成分. 考慮工藝生產過程、時間帶來的成本，類香味菌株優(yōu)先選擇3 d，而巨大芽孢桿菌優(yōu)先選擇1 d.

圖6 培養(yǎng)天數對有效磷含量的影響Fig.6 Effective phosphorus change with the cultured time

2.2 類香味菌解離煤矸石正交實驗

2.2.1 正交實驗結果

通過單因素實驗，發(fā)現兩種細菌解離煤矸石的四個主要因素為： 粒徑大小，體系pH值，接菌量和體系的培養(yǎng)時間. 根據單因素實驗結果，對兩株細菌分別設計了L9(3)4正交實驗，尋找類香味菌、巨大芽孢桿菌最佳的解離煤矸石條件和正交試驗條件，結果見表 1 和表 2.

表 1 類香味菌株的正交試驗以及結果

表 2 巨大芽孢桿菌的正交試驗以及結果

表 1，表 2 分別為類香味細菌與巨大芽孢桿菌解離煤矸石的正交試驗結果，實驗結果表明，當接菌量為50 mL, 培養(yǎng)天數為2 d, 煤矸石粒徑大小為140目以及體系pH為7的最佳實驗條件下，類香味細菌解離煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量為50.41 mg/kg； 當接菌量為50 mL, 培養(yǎng)天數為3 d, 煤矸石粒徑大小為20目以及體系pH為7.5的最佳實驗條件下，巨大芽孢桿菌解離煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量為 42.21 mg/kg.

2.2.2 解磷能力比較

將類香味細菌、巨大芽孢桿菌在最佳解離煤矸石條件下，進行同一來源煤矸石解離對比試驗，比較兩種菌株的解離效果，結果如表 3 所示.

表 3 兩種細菌最佳解磷條件及解離煤矸石結果

表 3 為最佳條件下，菌株解離煤矸石的實驗結果，發(fā)現解離后有效磷含量均高于原樣磷含量. 但兩株細菌最佳解離條件存在差異，巨大芽孢桿菌解離煤矸石的顆粒比類香味細菌大，最佳培養(yǎng)時間與類香味菌相差不大，實際的工業(yè)生產中，巨大芽孢桿菌在解離效率上有優(yōu)勢. 從解離煤矸石結果來看，類香味細菌處理后的有效磷提升5倍左右，而巨大芽孢桿菌處理后有效磷提升4倍左右，類香味細菌的解磷效果優(yōu)于巨大芽孢桿菌.

3 結 論

1) 新型解磷微生物細菌的發(fā)現，使得解磷細菌不再局限于土壤，同時具有處理煤系廢棄物煤矸石的潛力. 研究表明，篩選培育得到具有高效解磷能力的類香味細菌，能有效解離煤矸石，增加其中有效磷含量. 類香味細菌解離功能的發(fā)現，拓展了解磷微生物的研究范圍.

2) 正交實驗結果表明，類香味菌解離煤矸石最佳條件為： 接菌量為50 mL，培養(yǎng)天數為2 d，煤矸石粒徑大小為140目以及體系pH為7. 與傳統解磷細菌巨大芽孢桿菌對比研究表明，類香味細菌的解磷效果優(yōu)于巨大芽孢桿菌.

3) 采用新型細菌處理廢棄的煤矸石，是一種對環(huán)境非常友好的、溫和的、無污染的綠色化方法. 針對不同地域的煤矸石(或其它大宗工業(yè)廢料)，開發(fā)專用的微生物細菌，使其資源化成為可能，能有效地解決煤矸石對環(huán)境的危害.