IL-6對體外培養(yǎng)的牛眼小梁細(xì)胞中纖維連接蛋白的影響

劉 攀，孟 杰，劉玉震，王 強

0引言

原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是一類以房角開放、眼壓緩慢升高為特征的青光眼，具體的病理機制還不十分清楚。目前傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，其眼壓的緩慢升高與小梁網(wǎng)組織的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變導(dǎo)致房水流出阻力升高有關(guān)。當(dāng)前多采用眼壓監(jiān)測和全自動視野機等輔助檢查診斷POAG。而有研究指出，大于35%的就診者在被發(fā)現(xiàn)視野缺損之前可能已經(jīng)出現(xiàn)了視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失[1]，并且有流行病學(xué)統(tǒng)計報道，在有診斷意義的POAG視神經(jīng)損害的受試者中，約50%患者眼壓低于21mmHg[2]。因此僅以視野檢查和眼壓檢查作為POAG早期篩查的方法是非常局限的。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是常見的一種促炎性因子，其在多種疾病中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)其通過與T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用可參與氧化應(yīng)激和炎癥作用的過程[3-4]；還有研究指出，IL-6可以通過增加纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)的方式加速瘢痕增生并誘導(dǎo)肺動脈高壓形成[5-6]，在剝脫綜合征中，IL-6參與和促進(jìn)了FN蛋白的生成，并誘導(dǎo)了開角型青光眼的產(chǎn)生[7]。目前國內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報道，在POAG患者的房水和外周血液中，IL-6的含量較非青光眼患者均有所下降[8-11]，而此種改變對患者產(chǎn)生了何種影響尚無報道。因此我們推測IL-6的此種改變在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡和青光眼的發(fā)病機制中可能對FN存在影響，并以此改變POAG進(jìn)程。本實驗通過體外培養(yǎng)牛眼小梁細(xì)胞并模擬IL-6濃度改變的過程，進(jìn)一步監(jiān)測FN的變化，為探討青光眼患者發(fā)病時IL-6濃度變化對其病情進(jìn)展產(chǎn)生的作用，以及POAG的篩查與治療提供新思路。

1材料和方法

1.1材料新鮮摘取的2歲以下公牛眼球；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶(美國Hyclone公司)；PBS、BSA(北京Solarbio科技有限公司)；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；牛IL-6蛋白凍干粉、牛FN蛋白單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1牛眼小梁細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定采用組織塊培養(yǎng)法，摘取新鮮的牛眼眼球，去除眼外肌、結(jié)膜和筋膜組織，并用75%乙醇浸泡眼球5min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，距角膜緣約4mm處環(huán)形剪開眼球。翻轉(zhuǎn)眼前節(jié)組織，去除玻璃體，輕輕地撕除晶狀體和虹膜組織，體視顯微鏡下于白色的鞏膜突和Schwalbe線之間撕取小梁組織，平鋪于預(yù)置2mL胎牛血清的培養(yǎng)皿中，待組織貼壁干燥后加入8mL含20%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿放入體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞爬出并融合，采用貼壁細(xì)胞傳代的方法，傳代并培養(yǎng)至第3代。

1.2.2 IL-6工作液制備以超速離心機在4℃下3000r/min離心2min，使所有IL-6凍干粉沉積于EP管底。以無菌PBS溶液制備10mL的0.1% BSA溶液，以此PBS-BSA溶液復(fù)溶IL-6干粉并吹打，制成濃度為10μg/mL工作母液。取1mL 0.1% PBS-BSA溶液為A組(對照組)；取1μL母液溶于10mL 0.1% BSA溶液制成終濃度為0.1ng/mL的B組工作液；同樣方法制備濃度為0.5、1ng/mL的C組和D組工作液。

1.2.3 IL-6對小梁細(xì)胞的干預(yù)將生長良好的第3代牛眼小梁細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞鋪滿，以PBS沖洗培養(yǎng)板，分別加入2mL前述A～D組工作液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.4實時熒光定量PCR法檢測各組牛眼小梁細(xì)胞中FN mRNA的表達(dá)分別提取4組細(xì)胞的總mRNA，用分光光度計測定所提mRNA的濃度和純度，含量為1.5～2.0g/L；260nm與280nm處的吸光度比值為1.8～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟合成cDNA，并進(jìn)行實時熒光擴增，以β-actin為內(nèi)參照，內(nèi)參及目的基因FN引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。β-actin引物序列：上游：5’-CCATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游：5’-CGTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG-3’；FN引物序列：上游：5’-TGGCGAGTGGAAGTGTGAGAGG-3’，下游：5’-ATACGGAGGCGGCTGAGGATG-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)，每次擴增均設(shè)置β-actin為內(nèi)參對照。2-ΔΔCt法計算FN mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組牛眼小梁細(xì)胞中FN蛋白的表達(dá)取4組細(xì)胞使用預(yù)冷PBS洗滌3遍，棄去洗滌液。每孔細(xì)胞加400μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，用移液槍轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12 000r/min，離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一預(yù)冷的潔凈EP管中，即得所需蛋白；測量蛋白濃度，按4∶1的濃度加5×上樣緩沖液，煮沸15min，聚丙烯酰胺凝膠100V恒壓電泳分離60min后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用稀釋濃度分別為1∶1000和1∶4000的鼠來源的牛FN一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗進(jìn)行免疫酶聯(lián)反應(yīng)，曝光，得到膠片圖像。利用Image J軟件對所得灰度圖像進(jìn)行拍照和定量分析，得到目的蛋白FN與內(nèi)參β-actin灰度的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。

2結(jié)果

2.1牛小梁細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定小梁組織塊培養(yǎng)7～9d后可見大量細(xì)胞自組織邊緣爬出，呈長梭形、多角形，邊界清晰，排列緊密，大小不一，生長狀態(tài)良好(圖1A)。培養(yǎng)至第3代的牛小梁細(xì)胞形態(tài)和大小變化情況趨于穩(wěn)定，細(xì)胞中可見圓形細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)色素顆粒增多，符合既往本實驗室所培養(yǎng)的牛眼小梁細(xì)胞形態(tài)特征[12](圖1B)。

2.2小梁細(xì)胞在不同IL-6濃度下FN mRNA的變化實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，各組分別在0、0.1、0.5、1ng/mL IL-6刺激下FN mRNA的相對表達(dá)量分別為1.000±0.000、0.213±0.004、0.056±0.001、0.019±0.002，4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=77.13，P=0.001，圖2)。不同濃度IL-6下培養(yǎng)的牛眼小梁細(xì)胞產(chǎn)生的FN mRNA量呈下調(diào)趨勢(rs=-0.713，P<0.05)。經(jīng)LSD-t檢驗行兩兩比較：0ng/mL組與0.1、0.5、1ng/mL組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)；0.1ng/mL組與0.5、1ng/mL組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03、0.01)；0.5ng/mL組與1ng/mL組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049)。

圖1小梁細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定A：倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)9d的牛眼小梁細(xì)胞從小梁組織塊周邊游出，貼壁生長，形態(tài)多樣(×100)；B：第3代小梁細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定，呈梭形，有較多突起，細(xì)胞內(nèi)可見色素顆粒(×200)。

圖2不同濃度IL-6干預(yù)下各組小梁細(xì)胞中FN mRNA相對表達(dá)量。

圖3不同濃度IL-6干預(yù)下各組小梁細(xì)胞中FN蛋白表達(dá)量的比較A：FN蛋白電泳圖；B：FN蛋白相對表達(dá)量。

2.3小梁細(xì)胞在不同IL-6濃度下FN蛋白的變化蛋白質(zhì)免疫印跡法顯示，各組分別在0、0.1、0.5、1ng/mL IL-6刺激下FN蛋白相對表達(dá)含量分別為1.167±0.012、0.662±0.009、0.238±0.011、0.061±0.011，4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=95.01，P=0.01，圖3)。不同濃度IL-6下培養(yǎng)的牛眼小梁細(xì)胞產(chǎn)生的FN 蛋白量呈下調(diào)趨勢(rs=-0.901,P<0.05)。兩兩比較采用LSD-t檢驗：0ng/mL組與0.1、0.5、1ng/mL組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01、<0.001、<0.001)；0.1ng/mL組與0.5、1ng/mL組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01、<0.001)；0.5ng/mL組與1ng/mL組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04)。

3討論

目前POAG的確切病因還未完全證實，有學(xué)說認(rèn)為，小梁網(wǎng)組織是房水流出通道中最重要的一環(huán)，原發(fā)性開角型青光眼房角開放但眼壓升高是由于小梁組織的局部病變造成小梁途徑房水引流系統(tǒng)發(fā)生了病變，房水流出阻力增加所致[13]。同時也有文獻(xiàn)證明氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致POAG的病理原因之一[14]，有證據(jù)支持氧化應(yīng)激作為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglial cells，RGCs)的亞細(xì)胞區(qū)的組成部分，參與了青光眼性的神經(jīng)退行性變；除了直接的細(xì)胞毒性導(dǎo)致RGCs死亡外，ROS還很可能通過酶氧化特定的氨基酸殘基，并且作為第二信使和/或通過氧化還原修飾下游效應(yīng)物以調(diào)節(jié)蛋白功能，從而參與RGCs死亡信號的傳遞[15]。多種學(xué)說交匯，仍未有統(tǒng)一定論。

關(guān)于青光眼引起的組織損傷，目前大部分學(xué)者公認(rèn)是由于眼壓升高對神經(jīng)元、篩板和血管的機械性壓迫損傷。小梁網(wǎng)作為傳統(tǒng)的房水流出通道中最重要的組織之一，其上有大量的小梁細(xì)胞內(nèi)襯其中，位于近小管區(qū)和Schlemm管前部，是房水外流阻力最大的部分，其功能及其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化直接影響了眼壓的變化[16-18]。有實驗指出，小梁網(wǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞有分泌IL-6的功能[19]。而在POAG的基礎(chǔ)和臨床研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了POAG患者房水和血液中IL-6表達(dá)含量較非青光眼患者有所下降[8-11,20]，且房水引流通道中FN蛋白表達(dá)有所升高[21]。還有研究指出，POAG患者經(jīng)過6mo以上局部降眼壓藥物治療后，眼表的IL-6水平較正常人有所回升[22]。

細(xì)胞外基質(zhì)重塑對小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)改變起到了不可或缺的影響[23-24]。FN蛋白是已知的細(xì)胞外基質(zhì)之一，其不僅能通過增加小梁網(wǎng)細(xì)胞中整合素α5β1和α4β1的表達(dá)以促進(jìn)小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖、黏附和遷移能力[25-26]，并且FN蛋白的剛度與小梁組織的剛度呈正相關(guān)[27]，即FN蛋白數(shù)目與質(zhì)量對小梁組織形態(tài)結(jié)構(gòu)起到了影響。當(dāng)前在多種疾病中都發(fā)現(xiàn)有IL-6對FN蛋白影響的報道。例如剝脫綜合征是一類與年齡有關(guān)的彈性纖維系統(tǒng)疾病，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)中纖維物質(zhì)的病理性沉積，其在眼部表現(xiàn)為晶狀體皮質(zhì)在房角的物理堆積導(dǎo)致眼壓升高，激發(fā)開角型青光眼。而有實驗證明在剝脫綜合征導(dǎo)致的繼發(fā)性開角型青光眼中，IL-6參與誘導(dǎo)了纖維連接蛋白1(FN1)和TGF-β1的表達(dá)[7]。在增生性瘢痕(HS)形成的病理機制中，與正常成纖維細(xì)胞相比，HS中的細(xì)胞因子IL-6受體被激活引起輔助T淋巴細(xì)胞在STAT3中表達(dá)上升；同時STAT3肽會抑制FN凋亡基因的表達(dá)；在HS中，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖標(biāo)記物Cyclin D1、Bcl-X1和c-Myc表達(dá)均較正常人高[28]。

TGF-β是一組可調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡的細(xì)胞因子，其參與的多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路是促進(jìn)細(xì)胞和組織纖維化的重要途徑。曾有實驗指出：在體外培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞中TGF-β2眼內(nèi)灌流可使房水流出率減少約27%，并且促進(jìn)Schlemm管內(nèi)壁多層結(jié)構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)的聚集[29]，即TGF-β信號通過積累細(xì)胞外基質(zhì)的方式增加房水引流阻力，升高眼壓。Seong等[30]曾指出IL-6參與TGF-β誘導(dǎo)人肌腱成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化過程，并以此作為結(jié)膜下纖維化的重要過程。有日本學(xué)者曾做出實驗表示，可溶性IL-6反式信號(sIL-6)與其受體sIL-6R結(jié)合可增強STAT3磷酸化，同時sIL-6與受體結(jié)合后表現(xiàn)出以抑制Smad2的方式抑制TGF-β受體的作用，而當(dāng)TGF-β受體過度表達(dá)又將反作用抑制sIL-6反式信號的分泌和生成[10]。綜上所述，sIL-6反式信號以激活HTM中STAT3的方式抑制了TGF-β導(dǎo)致的纖維化。房水中同時存在著IL-6及其受體，以上實驗反而言之，在POAG患者前房中，當(dāng)IL-6濃度降低，IL-6與受體結(jié)合減少，TGF-β含量上升，同時IL-6-STAT3軸由于負(fù)反饋而被破壞，F(xiàn)N及其他細(xì)胞外基質(zhì)生成增多后堆積且降解降低，導(dǎo)致了房水引流受阻。而本實驗證實，IL-6通過影響FN轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)的方式，呈現(xiàn)出與FN的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即IL-6濃度越低，F(xiàn)N mRNA轉(zhuǎn)錄能力增強，小梁細(xì)胞產(chǎn)生的FN蛋白越多，側(cè)面證實了上述眾實驗的結(jié)論。不僅如此，我們還認(rèn)為，當(dāng)眼壓升高破壞血-房水屏障，可以使得房水中IL-6進(jìn)入血管內(nèi)壁，IL-6可通過改善細(xì)胞內(nèi)吞與轉(zhuǎn)運增加血管內(nèi)皮通透性[31-33]，從而使得血管中液體及其他促炎因子滲出，增加房水含量與前房炎癥反應(yīng)，能夠進(jìn)一步加重POAG患者眼部表現(xiàn)。

由于時間有限，本實驗并未加入IL-6抗體測得抗IL-6與FN的關(guān)系，是該實驗的局限性。下一步將由本實驗室進(jìn)一步印證IL-6與POAG之間的關(guān)系，以期IL-6的研究能夠為POAG的早期篩查與治療帶來新的治療思路和方法，以更加低廉、有效的途經(jīng)解決患者病痛。

最新中國科技核心期刊眼科學(xué)類期刊主要指標(biāo)及排名

刊名核心總被引頻次數(shù)值排名核心影響因子數(shù)值排名綜合評價總分?jǐn)?shù)值排名中華眼科雜志2040(3435)2(2)0.953(1.073)1(4)78.41眼科新進(jìn)展1273(545)3(4)0.690(1.344)4(3)60.52國際眼科雜志2446(5519)1(1)0.667(1.412)5(2)57.23中華眼底病雜志86550.878254.34中華實驗眼科雜志101840.692346.25臨床眼科雜志51370.523638.56眼科38780.398827.17中華眼視光與視覺科學(xué)雜志52860.390925.58中國斜視與小兒眼科雜志25690.470710.19 9種期刊平均值10360.629

摘編自2018版《中國科技期刊引證報告》核心版和擴展版(括號里面為擴展版的統(tǒng)計指標(biāo))