青光安對抗青光眼術后濾過道瘢痕化中膠原纖維、α-SMA及FN的影響

黃學思，彭 俊，蔣鵬飛，李苑碧，喻 娟，彭清華

0引言

青光眼是全球第二大致盲眼病[1]，目前治療方式是進行濾過性手術，而濾過道瘢痕化是濾過性手術失敗最主要的原因。研究表明，膠原纖維、以α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)為特征表達的肌成纖維和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是濾過性手術后瘢痕形成的關鍵因素之一[2]。盡管抗代謝藥物如絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)等在手術中的應用大大挺高了手術的成功率[3]，但是此類藥物廣泛作用于眼部組織，會導致濾過泡滲漏、眼內(nèi)感染等一系列并發(fā)癥，易給患者本來已經(jīng)損傷的視功能帶來新的威脅[4]。本課題組自主研制的青光安顆粒劑具有活血化瘀、利水明目的功用，應用于術后抗濾過道瘢痕化療效顯著。本課題組前期通過在青光安顆粒劑中藥組份庫中建立高通量篩選藥物體系[5-6]，已經(jīng)篩選出4種青光安有效組份。本實驗將4種青光安有效組份、青光安中藥混懸液以及絲裂霉素C應用于手術動物模型，通過觀察各組抑制膠原纖維、α-SMA和FN的表達情況，進而抑制瘢痕組織增生的效果，來對比各有效組份術后抗濾過道瘢痕化的實際療效，為研制治療青光眼的藥物提供有力的物質(zhì)基礎支撐。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級新西蘭長耳白兔48只(由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供)，體質(zhì)量1.5～2.0kg，雌雄各半，實驗前排除雙眼及全身病變，實驗動物飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學實驗樓動物實驗中心SPF級實驗房，濕度50%～55%，室溫(23±2)℃，實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[7]的規(guī)定。

1.1.2主要儀器設備和手術器材-80℃超低溫冰箱(中科美菱，DW-HL538)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，YXQ-LS-SⅡ)、凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-1D)、電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，101-1AB型)、低溫臺式高速離心機(赫西儀器裝備有限公司，HR/T 16M)、超微量分光光度計(美國，Nanodrop)、凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)、微量移液器(德國，Eppendorf)、臺式高速冷凍離心機(Thermo)、水平電轉(zhuǎn)槽(北京六一儀器廠，DYCP-40C)、超純水儀(Millipore公司)、紫外可見分光光度計(上海Spectrum公司，SP-752)、恒溫搖床(金壇，THZ-82A)、水平搖床(北京六一儀器廠，WD-9405B)、掃描儀(日本Canon，9000F MarkⅡ)。

1.1.3主要藥品和試劑水合氯醛(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號20151023)、絲裂霉素C、青光安4種有效組份、青光安混懸液、4%多聚甲醛、α-SMA單克隆抗體、FN單克隆抗體、SABC即用型試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)、DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組將48只兔按體質(zhì)量平均分到A組(空白組)、B組(模型組，即手術對照組)、C組(絲裂霉素C對照組)、D組(有效組份1組)、E組(有效組份2組)、F組(有效組份3組)、G組(有效組份4組)、H組(青光安混懸液組)，每組6只兔子。

1.2.2青光眼濾過手術動物模型建立耳緣靜脈注射10%水合氯醛溶液(按2～4mL/kg)麻醉兔子，使用壓陷式眼壓計測每只兔子術眼3次眼壓取平均值(保留小數(shù)點后1位數(shù))并記錄。生理鹽水沖洗術眼結膜囊后滴0.1%丁卡因進行局部麻醉，在手術顯微鏡下行雙眼小梁切除+虹膜根部切除術[8]，除A組外，所有兔子均形成濾過泡。

1.2.3給藥方法A組、B組：術后第1d開始以生理鹽水10mL/kg灌胃，每日1次，持續(xù)4wk。 C組：術中切除鞏膜和小梁組織前使用MMC，參照MMC在青光眼手術中的常用方法[5]，術后灌胃頻率、方法、時間同A、B組。D組、E組、F組、G組：術后第1d開始以不同組份給藥，體表面積折算的等效劑量比值計算[6]，算出兔子的用藥劑量，溶于生理鹽水中，頻率、方法、時間同A、B組。H組：術后第1d開始以成人臨床等效劑量的3.27倍給藥，溶于生理鹽水中，頻率、方法、時間同A、B組。

1.2.4術后眼壓測量與固定取材本實驗中眼壓的測量方法參照文獻[8]進行。灌胃4wk后第1d取材?？諝馑ㄈㄌ幩劳米雍螅⒓磳⒀矍蛲暾〕龉潭ㄓ?%多聚甲醛溶液中[9]，剪取眼球上手術區(qū)10mm×10mm范圍內(nèi)的方形全層眼球壁及其周邊組織，制作成石蠟切片備行Masson染色。

1.2.5濾過泡區(qū)域內(nèi)膠原纖維、α-SMA、FN的表達情況膠原纖維：取部分石蠟切片進行Masson染色后，在光鏡400倍視野下隨機選擇5個高倍視野，觀察膠原纖維占視野面積的比值情況，并取平均值作統(tǒng)計學分析。取部分石蠟切片做免疫組化后，在光鏡400倍視野下隨機選擇5個高倍視野，測定α-SMA、FN的平均光密度，計算平均值作為樣本中α-SMA、FN的表達量。

2結果

2.1術后各組眼壓測量情況實驗中無兔子死亡或消耗，除A組外，各組術前、術后2d，1、2、4wk眼壓比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，不同時間點間的眼壓差異有統(tǒng)計學意義(F=13.831，P=0.002)。B組術后2、4wk眼壓相比術前，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明B組手術2wk后眼壓已基本恢復到術前水平。C組術后各時期相比術前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明C組在手術后眼壓一直處于較低水平。D組術后4wk相比術前，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明D組所用藥物組份在術后4wk對抑制眼壓上升無明顯作用。E組術后各時期相比術前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明E組所用組份對于抑制眼壓上升有效。F組術后4wk相比術前，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明F組所用組份在術后4wk對于抑制眼壓上升無效。G組術后2、4wk相比術前，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明G組所用組份在術后2、4wk對于抑制眼壓上升無效。H組術后各時期相比術前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明H組所用組份對于抑制眼壓上升有效。同一時間點不同組別的眼壓有差別(F=27.256，P<0.001)。術后2wk B組與A組相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.801，P=0.221)，術后2wk G組與A組相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=2.114，P=0.030)，表明手術2wk后G組對于抑制眼壓上升無效，見表1。

圖1各組濾過泡區(qū)域膠原纖維表達情況(Masson染色×400)A：A組膠原纖維較少，形態(tài)規(guī)則，排列整齊；B:B組膠原纖維大量增生，排列不規(guī)則；C：C組膠原纖維增生較少，排列尚規(guī)則；D：D組膠原纖維增生較多，排列較為紊亂；E：E組膠原纖維密度較低，排列尚規(guī)則；F：F組可見大量生成的膠原纖維排列不規(guī)則；G：G組膠原纖維致密粗大，排列不規(guī)則；H：H組膠原纖維排列稀疏，且邊界清楚。

組別術前術后2d 術后1wk 術后2wk 術后4wk A組17.64±0.5917.17±1.3716.80±0.4616.37±0.7016.69±0.85B組16.72±1.249.50±0.95a,c13.85±0.95a,c16.02±0.8116.40±0.80C組17.15±1.148.73±0.89a,c9.33±1.07a,c10.56±1.39a,c11.08±1.73a,cD組16.51±1.389.08±0.78a,c11.54±0.98a,c14.16±1.06a,c15.63±1.63E組17.55±0.889.25±0.59a,c11.49±0.89a,c12.11±0.99a,c13.77±0.69a,cF組17.84±1.129.19±0.98a,c11.60±0.91a,c14.54±1.23a,c15.13±1.80aG組17.55±1.069.58±0.85a,c12.22±0.79a,c15.58±0.5916.42±0.51H組18.26±1.089.25±0.67a,c10.93±0.80a,c11.88±0.79a,c13.49±0.62a,c

注：A組：空白組；B組：模型組，即手術對照組；C組：絲裂霉素C對照組；D組：有效組份1組；E組：有效組份2組；F組：有效組份3組；G組：有效組份4組；H組：青光安混懸液組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vs同組術前。

2.2濾過泡區(qū)域膠原纖維表達情況各組濾過泡區(qū)膠原纖維面積比值相比A組(0.0512±0.0078)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明各組濾過泡區(qū)膠原纖維都有不同程度增殖。D組(0.1774±0.0047)、G組(0.1829±0.0188)相比B組(0.1840±0.1505)，差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.1074，P=0.458；t=0.0178，P=0.493)，說明D組和G組所用藥物組份對于抑制膠原纖維增殖基本無效。C組(0.0732±0.0109)、E組(0.0824±0.0105)、F組(0.1294±0.0375)、H組(0.0970±0.0150)相比B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明E組、F組采用的藥物組份對于抑制膠原纖維增殖有效。H組相比E組，差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.953，P=0.960)，說明其抑制膠原纖維增殖的效果與E組無明顯差異。各組膠原纖維表達情況見圖1。

2.3濾過泡區(qū)域α-SMA表達情況各組α-SMA平均光密度相比A組(0.290±0.032)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明各組肌成纖維都有不同程度增殖。G組(0.594±0.042)相比B組(0.606±0.036)，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.531，P=0.303)，說明G組藥物組份對于抑制α-SMA增殖基本無效。而C組(0.392±0.047)、D組(0.543±0.038)、E組(0.459±0.046)、F組(0.493±0.024)、H組(0.424±0.030)相比B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明D組、E組、F組所用的藥物組份對于抑制α-SMA增殖有效。H組相比E組，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.561，P=0.075)，說明其抑制α-SMA增殖的效果與E組無明顯差異。各組α-SMA表達情況見圖2。

圖2各組濾過泡區(qū)域α-SMA表達情況(SABC×400)A：A組正常組織α-SMA含量少，陽性細胞不明顯；B：B組α-SMA高度表達，排列致密，形態(tài)不規(guī)則；C:C組α-SMA表達較少，排列稀疏；D：D組α-SMA表達明顯增高；E：E組α-SMA表達較C組有所增加，但排列尚整齊；F：F組α-SMA表達較E組有所增加，排列不規(guī)則；G：G組α-SMA表達明顯增高，排列不規(guī)則；H：H組α-SMA表達不明顯，排列較稀疏。

圖3各組濾過泡區(qū)域FN表達情況(SABC×400)A:A組正常組織中FN表達較少；B：B組FN高度表達，排列致密，形態(tài)不規(guī)則；C:C組FN表達較正常組高，但是低于其他組；D：D組FN表達明顯增高，僅次于B組；E：E組FN表達較C組高，排列尚整齊；F：F組FN表達較E組多，且排列致密；G：G組FN呈高度表達，排列紊亂致密；H:H組FN表達較C組增高，但不及E組，排列較稀疏。

2.4濾過泡區(qū)域FN表達情況各組FN平均光密度相比A組(0.250±0.075)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明各組FN都有不同程度增殖。D組(0.625±0.077)、G組(0.592±0.073)相比B組(0.642±0.067)，差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.408，P=0.346；t=1.236，P=0.122)，說明D組、G組藥物組份對于抑制FN增殖基本無效。而C組(0.368±0.038)、E組(0.447±0.110)、F組(0.540±0.090)、H組(0.390±0.077)相比B組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明這些組對于抑制FN增殖都有不同程度的效果。H組相比E組，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.040，P=0.161)，說明其抑制FN的增殖效果與E組無明顯差異。各組FN表達情況見圖3。

3討論

青光眼濾過性手術術后濾過道瘢痕化是青光眼濾過性手術失敗的主要原因[9]，目前普遍認為瘢痕形成主要與膠原纖維合成增多、成纖維細胞以及肌成纖維細胞的增生有關。α-SMA是肌成纖維細胞的重要構成部分[10]，其在肌成纖維細胞中的高表達會使肌成纖維細胞處于活化狀態(tài)[11-12]，肌成纖維細胞合成膠原的能力顯著提升，最終瘢痕形成，導致青光眼濾過性手術失敗[13]。FN是對膠原蛋白有特殊親和力的高分子糖蛋白，創(chuàng)傷處的成纖維細胞合成纖維連接蛋白[14]，構成細胞外基質(zhì)的骨架，參與抗青光眼濾過性手術術后瘢痕形成[15]。

青光安顆粒劑是彭清華教授在中醫(yī)理論的指導下，以益氣養(yǎng)陰、活血利水為原則，研制而成中藥復方制劑[16]。青光安顆粒劑能明顯減少術后濾過道瘢痕的形成，前期的動物實驗研究未發(fā)現(xiàn)青光安顆粒劑4種有效組份對眼部組織的毒副作用，可能成為抗青光眼術后濾過道瘢痕化，提高手術成功率的一個全新安全藥物。為了進一步研究青光安抗青光眼術后濾過道瘢痕化的作用機制，本課題組前期通過對青光安50多種中藥組份建立高通量篩選體系，篩選出4種青光安有效組份，它們均可以有效抑制成纖維細胞增殖，減少細胞外基質(zhì)的合成，抑制青光眼術后濾過道瘢痕化。

本實驗以青光安4種有效組份與空白組、模型組、MMC組及青光安混懸液組進行比較，在術后眼壓方面、濾過道瘢痕化方面對4種組份的療效進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)MMC組、有效組份2組和青光安混懸液組能有效控制青光眼濾過性手術術后眼壓；MMC組、有效組份2組、有效組份3組和青光安混懸液組均可有效抑制膠原纖維增殖，其中MMC組效果最佳；MMC組對α-SMA增殖有明顯的抑制作用，有效組份2組、有效組份3組與青光安混懸液組也可有效抑制α-SMA增殖，有效組份1組與有效組份4組對α-SMA增殖幾乎無抑制作用；MMC組對FN增殖有明顯抑制作用，青光安混懸液組、有效組份2組及有效組份3組對FN增殖均有抑制作用，有效組份4組與有效組份1組對FN增殖抑制作用不明顯。

本實驗表明，MMC、青光安有效組份2、青光安有效組份3及青光安混懸液通過抑制α-SMA及FN的增殖而體現(xiàn)出對肌成纖維細胞及成纖維細胞的抑制作用，具有明顯的抗瘢痕化作用。