GOLPH3在6種腫瘤中的表達特點*

于莉娜, 田燕, 趙佩佩, 翁雅倩, 劉楨, 華興

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系， 廣東 廣州 510515； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004； 4.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會醫(yī)院， 廣東 廣州 510220)

反面高爾基網(wǎng)的癌基因GOLPH3(golgi phosphorprotein-3)又名GPP34/GMx33/MIDAS，是定位于人類染色體5p13.3、全長3.1 kb、編碼分子量為34 kD的磷酸化高爾基體膜蛋白，亦是近年來發(fā)現(xiàn)的首個定位于反面高爾基網(wǎng)(TGN)的癌基因[1]。以往研究認為，定位于TGN的蛋白質(zhì)與腫瘤的發(fā)生無直接相關(guān)性[2]；但近年研究顯示，在蛋白質(zhì)的修飾中TGN發(fā)揮重要作用，尤其在腫瘤表觀遺傳學(xué)中的作用可能遠遠超過預(yù)期，定位于TGN的癌基因GOLPH3在多種實體瘤中的異常擴增現(xiàn)象就是有力佐證[3]。目前關(guān)于GOLPH3在腫瘤領(lǐng)域所發(fā)揮的確切作用及其機制尚未明確，且缺乏系統(tǒng)的研究和報道。本研究應(yīng)用生物信息技術(shù)對GOLPH3的腫瘤組織分布情況進行分析，篩選出表達上調(diào)的癌組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢查這些上調(diào)癌組織中GOLPH3蛋白的表達水平，采用逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測上調(diào)腫瘤細胞株中GOLPH3 mRNA表達水平， 探究GOLPH3與這幾種不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的科學(xué)依據(jù)，亦為腫瘤的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及試劑

1.1.1組織 病例來源于廣州市南方醫(yī)院病理科2013年1月～2015年12月確診并經(jīng)手術(shù)切除獲得的胃腺癌(STAD)、肝細胞癌(HCC)、乳腺癌(BRCA)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)、睪丸生殖細胞腫瘤(TGCT)及前列腺癌(SART)組織石蠟標(biāo)本各30例，選擇其癌旁正常組織石蠟標(biāo)本各10例作為對照組。采用連續(xù)切片的方式處理所有組織標(biāo)本(厚4 μm)。

1.1.2細胞株 人STAD細胞株BGC-823、SGC-790，正常胃黏膜上皮細胞株RGM-1，人HCC細胞株Hep G2、HHCC，人永生化肝細胞株THLE-2，人BRCA細胞株MCF7、SKBr-3，人正常乳腺上皮細胞株MCF10A，人SART細胞株LNCap、PC3，人正常前列腺上皮細胞株RWPE-1，均購自美國ATCC。

1.1.3主要試劑 兔抗人GOLPH3多克隆抗體(購自美國Abcam公司)，即用型EliVisionTMplus試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(PBS，購自福州邁新生物技術(shù)有限公司)，總RNA提取試劑(購自美國Invitrogen公司)，PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex Taq試劑盒(購自日本TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1GOLPH3的數(shù)字化細胞表達譜分析 以GOLPH3為查詢對象，應(yīng)用GCBI-基因雷達數(shù)據(jù)庫進行搜索，統(tǒng)計GOLPH3在不同腫瘤細胞中的表達豐度。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 組織標(biāo)本均在同一條件下采用SP法進行免疫組織化學(xué)染色：65 ℃烤片2 h，利用二甲苯及不同濃度乙醇試劑完成脫蠟及水化處理，利用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)抗原后使用雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉液處理1 h，加入相應(yīng)目的蛋白的一抗，4 ℃孵育過夜，使用PBS清洗3次；二抗室溫孵育2 h，同樣使用PBS清洗樣本3次(5 min/次)，通過DAB顯色，蘇木素復(fù)染及樹膠封片后，使用光學(xué)顯微鏡采集圖片及分析。選用已知陽性的肺腺癌標(biāo)本作為陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照。

1.2.3qRT-PCR檢測 將各種細胞種植于6孔板中，待細胞長滿后加入Trizol(1 mL/孔)，充分吹勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP中，冰上裂解30 min；加入三氯甲烷200 μL，劇烈震蕩后，靜置2 min，在4 ℃及12 000 r/min條件下離心15 min；將上層透明液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入等量的異丙醇，緩慢輕柔地上下顛倒混勻，冰上靜置10 min，再在4 ℃及12 000 r/min條件下離心10 min。去上清，加入75%乙醇溶液清洗沉淀，在4 ℃及12 000 r/min條件下離心10 min；去上清，干燥沉淀后，加入適量的DEPC水溶解沉淀。使用微量紫外分光光度計檢測樣本RNA濃度。以RNA總量1 000 ng的標(biāo)準(zhǔn)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。GOLPH3基因上下游引物序列分別為5′-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3′和5′-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3′；內(nèi)參GAPDH基因上下游引物序列分別為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′和5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，每個樣本的檢測均設(shè)立3個重復(fù)孔，利用ΔΔCT算法計算目的基因的相對表達量。

1.2.4結(jié)果判定 細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為GOLPH3表達陽性細胞，符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)細胞結(jié)構(gòu)清晰，(2)陽性顆粒定位準(zhǔn)確，(3)著色程度明顯高于背景且對比清楚。按陽性細胞的數(shù)量評分(A)：陽性細胞數(shù)≤15%記1分，陽性細胞數(shù)為16%～75%記2分，陽性細胞數(shù)≥75%記3分；按細胞染色程度評分(B)：無顯色細胞記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分?？偡謹?shù)(T)=A×B，T=0時判定為“-”，T=1～2時判定為“+”，T=3～4時判定為“++”，T=6～9時判定為“+++”，“+～+++”為陽性表達。隨機選擇5～10個高倍鏡視野觀察并評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GOLPH3的數(shù)字化組織表達譜

結(jié)果顯示，GOLPH3廣泛表達于人類大多數(shù)正常組織，在STAD、BRCA、UCEC及TGCT等多種腫瘤細胞中的表達顯著上調(diào)。見圖1。

圖1 GOLPH3在不同腫瘤細胞中的表達情況Fig.1 The expression of GOLPH3 in different tumor cells

2.2 GOLPH3蛋白在6種常見惡性腫瘤中的表達

結(jié)果顯示，GOLPH3表達的陽性信號定位于細胞質(zhì)內(nèi)，在癌旁組織中多為弱陽性表達(+)，中等強度陽性表達率僅為8.3%，而在相應(yīng)STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等腫瘤組織中，GOLPH3的表達顯著升高，多為中強表達(++/+++)。中強度陽性表達率為96.7%，與相應(yīng)癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖2。

表1 GOLPH3在6種惡性腫瘤組織與癌旁組織中的表達Tab.1 Expression of GOLPH3 in malignant tumors and adjacent normal tissues

注：a為胃、b為肝、c為乳腺、d為子宮內(nèi)膜、e為睪丸、f為前列腺，A為STAD、 B為HCC，C為BRCA、D為UCEC、E為TGCT、F為SART圖2 GOLPH3在6種常見惡性腫瘤與癌旁正常組織中的表達水平(SP，×200)Fig.2 The expression level of GOLPH3 in common malignant tumors and adjacent normal tissues

2.3 GOLPH3 mRNA在4種常見惡性腫瘤細胞株的表達

結(jié)果顯示，GOLPH3 mRNA在人STAD細胞株、人HCC細胞、人BRCA細胞株及人SART細胞株中的表達水平均顯著高于其相對應(yīng)的正常細胞株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

(1)與正常細胞株比較，P<0.05圖3 GOLPH3 mRNA在4種常見惡性腫瘤細胞株的表達(qRT-PCR)Fig.3 The expression of GOLPH3 mRNA in four common malignant tumor cell lines and their corresponding control cell lines

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的突飛猛進，新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因也日益增多[4-6]。在正常細胞基因組中，一旦發(fā)生突變或被異常激活后可使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因稱之為癌基因，癌基因反映的是一種功能的獲得，即獲得使細胞發(fā)生癌變的能力。但是這種功能的獲得并不是癌基因的唯一作用[7]，正常細胞的生長、分化和增殖均需要原癌基因的參與[8]。因此確切地說，癌基因是一類具有正常的生物學(xué)功能，僅在特殊條件下才會使細胞發(fā)生癌變的一類基因[9]。

GOLPH3自首次報道以來，一直被認為是一種磷酸化的高爾基體膜蛋白，參與執(zhí)行細胞正常的高爾基體的蛋白質(zhì)分選功能[10]。直到2009年Nature有文章提出，GOLPH3是首個定位于TGN的癌基因[1]，能夠促進腫瘤的發(fā)生[11-14]。隨后這一研究成果引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，認為GOLPH3是一個真正意義上的且具有強大轉(zhuǎn)化能力的癌基因[15-20]。目前關(guān)于GOLPH3癌基因功能的研究尚處于起步階段，其在人體常見惡性腫瘤組織中是否均存在基因活化現(xiàn)象、是否也具有癌基因特性等尚缺乏系統(tǒng)性報道。

生物信息學(xué)技術(shù)是研究新基因并進行功能研究的重要手段，已廣泛地滲透到醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。本研究首先通過GCBI數(shù)據(jù)庫對GOLPH3的腫瘤組織分布情況進行初步分析，結(jié)果顯示GOLPH3廣泛表達于人類大多正常組織，在大部分腫瘤細胞株如STAD、BRCA、UCEC、TGCT及SART中存在顯著的表達上調(diào)；隨后，本研究選擇臨床較常見的相應(yīng)腫瘤組織標(biāo)本進行GOLPH3表達驗證，結(jié)果顯示，GOLPH3蛋白在全身多器官癌組織旁的正常組織中多呈低表達(+)，與GCBI數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，提示GOLPH3作為原癌基因在正常細胞中具有活性，參與細胞正常的生物學(xué)功能，而在STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等惡性腫瘤組織中，GOLPH3的表達量相對其配對的正常組織顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由于胃、肝、乳腺及前列腺腫瘤發(fā)病率高且嚴重危害人們生命健康，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)從細胞水平檢測了人STAD細胞株、人肝細胞癌細胞、人BRCA細胞株及人SART細胞株及其相對應(yīng)的正常細胞株中GOLPH3 mRNA表達水平，結(jié)果顯示腫瘤細胞株中GOLPH3 mRNA表達顯著高于相對應(yīng)的正常細胞株(P<0.01)。以上結(jié)果均提示在部分惡性腫瘤中GOLPH3作為原癌基因被活化，參與了相應(yīng)腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，目前關(guān)于腫瘤標(biāo)志物的研究發(fā)展飛速，迄今為止，GOLPH3是首個也是唯一被發(fā)現(xiàn)的定位于TGN的癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，GOLPH3表達量的上調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著對GOLPH3基因研究的進一步深入，將有力的推動腫瘤的表觀遺傳學(xué)研究，為多種常見惡性腫瘤的診治提供新的思路和線索。