2種烷基多環(huán)芳烴對(duì)仿刺參CYP450和p53基因表達(dá)的影響研究

李香，魏海峰1,,*，劉長發(fā)，宋雪，趙肖依，趙雨朦，夏寧，霍玉潔

1. 大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)，海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023 3. 大連海洋大學(xué)，近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023

近年來由于突發(fā)海洋溢油事故和沿海石油化工業(yè)的發(fā)展，大量石油烴類污染物通過各種途徑進(jìn)入海洋中，成為潛在的危害我國海洋生態(tài)環(huán)境安全的重要因素之一。石油毒性主要來源于其中的多環(huán)芳烴(PAHs)組分，多環(huán)芳烴類約占石油組分的1%～6%，其中80%～90%為烷基化多環(huán)芳烴[1]。前期國內(nèi)外大量研究多關(guān)注16種優(yōu)先控制的多環(huán)芳烴，而對(duì)多環(huán)芳烴的衍生物關(guān)注極少，這可能導(dǎo)致由多環(huán)芳烴衍生物造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)被低估[2]。菲和蒽是最具代表性的三環(huán)多環(huán)芳烴，在石油中含量較高，關(guān)于其毒性的研究報(bào)道較多[3-4]。3-甲基菲和2-甲基蒽是菲和蒽的烷基化衍生物，國內(nèi)外關(guān)于這2種衍生物毒性的報(bào)道較少，有必要對(duì)其毒性效應(yīng)進(jìn)行研究。

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)和p53基因都是常用的分子生物標(biāo)志物，它們均在外源物質(zhì)的代謝和解毒方面起重要作用[5-6]。CYP450是生物體內(nèi)含有多種超家族CYP450血紅蛋白或相同結(jié)構(gòu)域的酶系，對(duì)許多外源及內(nèi)源化合物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化具有重要的作用[7]。環(huán)境中的有機(jī)污染物進(jìn)入生物體內(nèi)后，可誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞色素P450酶系CYP活力顯著增加或降低，利用生物代謝過程中CYP含量或活力與污染物毒性之間的響應(yīng)關(guān)系,可將CYP450作為毒物毒性的生物標(biāo)記物,進(jìn)行環(huán)境污染的早期診斷。但由于大多數(shù)P450酶的含量很低且不穩(wěn)定,直接分離純化P450酶非常困難，因此在克隆P450基因的基礎(chǔ)上,研究多環(huán)芳烴類污染物對(duì)CYP450基因表達(dá)的影響[8-9]。抑癌基因p53在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，DNA損傷以及不正常的細(xì)胞增殖信號(hào)都會(huì)引起P53蛋白的激活[10],由于其功能的多樣性及與腫瘤發(fā)生的高度相關(guān)性，研究環(huán)境有毒化合物對(duì)p53基因的損失對(duì)闡明化合物遺傳毒作用、分子機(jī)制以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要的科學(xué)意義[6]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是黃、渤海重要底棲生物類群，主要攝食底泥中細(xì)菌、底棲硅藻和有機(jī)質(zhì)碎屑[11]。作為我國重要海水增養(yǎng)殖品種之一，其生物學(xué)數(shù)據(jù)基本完備、并且取材方便，是海洋環(huán)境污染物生物毒性評(píng)價(jià)的理想受試生物[12]。林芳等[13]和靳非等[2]分別進(jìn)行了多環(huán)芳烴類污染物對(duì)翡翠貽貝(Pernaviridis)胚胎和河鲀(Takifugurubripes)幼魚的毒理學(xué)研究。相比貝類、魚類而言，國內(nèi)外對(duì)于多環(huán)芳烴類污染物對(duì)海參的毒理學(xué)效應(yīng)研究較少。因此，本文選擇仿刺參(A.japonicus)為受試生物，設(shè)置3種不同濃度的3-甲基菲和2-甲基蒽處理健康仿刺參，檢測(cè)其體內(nèi)CYP450和p53基因的相對(duì)表達(dá)量，分析仿刺參CYP450和p53基因的表達(dá)與3-甲基菲和2-甲基蒽的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-毒性效應(yīng)關(guān)系，為開展2種多環(huán)芳烴污染物對(duì)海洋生物毒性評(píng)價(jià)篩選敏感標(biāo)志物。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：Nano Photometer微量核酸蛋白分析儀(德國Implen)，CT15RE型臺(tái)式微量高速離心機(jī)(日本Hitachi)，Mx3005pTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Stratagene)，ZHWY-200D恒溫?fù)u床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

試劑：2-甲基蒽和3-甲基菲購自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，純度分別大于97%和98%；丙酮(分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，上海)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit II(TaKaRa)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用海水取自大連黑石礁海域的砂濾海水，仿刺參(A.japonicus)的幼參購自大連太平洋海珍品有限公司，體長(水中)為(2±0.3) cm，經(jīng)清潔海水馴養(yǎng)2周后，選取健康幼參用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 多環(huán)芳烴毒性實(shí)驗(yàn)

用1 L玻璃燒杯洗凈后裝入海水，加入一定濃度3-甲基菲和2-甲基蒽儲(chǔ)備液，設(shè)置3-甲基菲濃度分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1和100 μg·L-1，2-甲基蒽濃度分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1和50 μg·L-1，同時(shí)設(shè)置海水對(duì)照組和丙酮對(duì)照組，各處理組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)燒杯中放入10只幼參。試驗(yàn)條件：水溫(15±2) ℃，鹽度(30±1)，pH (8.0±0.5)，間斷性充氧，確保溶解氧大于4.5 mg·L-1，避光。

1.4 樣品采集及RNA提取

3-甲基菲和2-甲基蒽處理3 d、7 d、14 d后，取各處理組幼參一只放于冰上，用移液槍抽取海參體液，裝入tube管中迅速投入準(zhǔn)備好的液氮中，-80 ℃保存。Trizol法提取上述樣品的總RNA，DNase I進(jìn)行DNA消化處理，微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度，Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA完整性。

1.5 基因表達(dá)水平測(cè)定

分別取上述樣品總RNA用Prime-ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用Mx3005pTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit II進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以β-Actin作內(nèi)參，相關(guān)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列見表1。

反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；55 ℃，25 s；72 ℃，25 s，40個(gè)循環(huán)。利用delta-delta Ct法，通過仿刺參的內(nèi)標(biāo)基因AB510191.1(Actin)的校正，對(duì)仿刺參樣品中CYP450和p53基因表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。設(shè)置P<0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 3-甲基菲、2-甲基蒽對(duì)仿刺參CYP450基因表達(dá)的影響

3-甲基菲和2-甲基蒽對(duì)仿刺參CYP450基因表達(dá)的影響如圖1所示。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，3-甲基菲(c≥5 μg·L-1)和2-甲基蒽(c≥10 μg·L-1)在一定濃度脅迫下，對(duì)仿刺參CYP450基因的表達(dá)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)。2-甲基蒽在濃度5 μg·L-1脅迫14 d后，對(duì)CYP450基因的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。隨著時(shí)間增加，海水對(duì)照組CYP450基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，丙酮對(duì)照組CYP450基因的相對(duì)表達(dá)量不斷增大，說明丙酮促進(jìn)了仿刺參CYP450基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，3-甲基菲暴露14 d后，CYP450基因的整體相對(duì)表達(dá)量小于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，隨著濃度的升高，CYP450基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸增大，100 μg·L-1處理組與10 μg·L-1處理組相比，差異不顯著(P>0.05)。用2-甲基蒽暴露14 d后，隨著濃度的升高CYP450基因的表達(dá)量受到明顯的抑制，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。連續(xù)暴露14 d后，仿刺參CYP450基因相對(duì)表達(dá)量在3-甲基菲濃度為5 μg·L-1脅迫下達(dá)到最小值0.21，在2-甲基蒽濃度為50 μg·L-1脅迫下達(dá)到最小值0.16。

表1 相關(guān)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

圖1 3-甲基菲、2-甲基蒽對(duì)仿刺參CYP450基因表達(dá)的影響注：標(biāo)有不同小寫字母者表示顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示無顯著性差異(P>0.05)，圖表橫坐標(biāo)中B表示空白對(duì)照組，B-B表示溶劑對(duì)照組，下同。Fig. 1 The effects of 3-methylphenanthrene, 2-methylanthracene on the CYP450 gene expression of Apostichopus japonicusNote: The different letters mean significant differences at the 0.05 probability level, and the same letters mean no significant differences; B represents the seawater control group and B-B represents the acetone control group.

圖2 3-甲基菲、2-甲基蒽對(duì)仿刺參p53基因表達(dá)的影響Fig. 2 The effects of 3-methylphenanthrene, 2-methylanthracene on the p53 gene expression of Apostichopus japonicus

2.2 3-甲基菲、2-甲基蒽對(duì)仿刺參p53基因表達(dá)的影響

3-甲基菲和2-甲基蒽仿刺參p53基因表達(dá)的影響如圖2所示。3-甲基菲和2-甲基蒽脅迫初期(3 d)對(duì)仿刺參p53基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)出規(guī)律不一致的變化，與對(duì)照組相比，3-甲基菲各處理組對(duì)仿刺參p53基因的表達(dá)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，且隨著脅迫濃度的升高，抑制作用逐漸減小，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，2-甲基蒽各處理組對(duì)仿刺參p53基因的表達(dá)也均表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，但隨著脅迫濃度的升高，抑制作用逐漸增大。3-甲基菲脅迫中期(7 d)，隨著脅迫濃度的升高，仿刺參p53基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后降低的規(guī)律，2-甲基蒽脅迫中期(7 d)，各處理組對(duì)仿刺參p53基因的表達(dá)均表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，且隨著脅迫濃度的升高，仿刺參p53基因的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)出與3-甲基菲脅迫相似的規(guī)律，也呈先升高后降低的趨勢(shì)。3-甲基菲和2-甲基蒽脅迫后期(14 d)，與對(duì)照組相比，各處理組均對(duì)仿刺參p53基因的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，且均在脅迫濃度為10 μg·L-1時(shí)仿刺參p53基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最小值。

3 討論(Discussion)

CYP450和p53基因的表達(dá)在3-甲基菲和2-甲基蒽污染物脅迫下整體上均表現(xiàn)出抑制作用，說明在外源污染物進(jìn)入仿刺參體內(nèi)時(shí)，CYP450和p53基因的表達(dá)均能對(duì)毒物產(chǎn)生響應(yīng)以維持仿刺參正常的生理活動(dòng)，但二者的具體響應(yīng)程度及對(duì)2種污染物的耐受閾值存在差異，這可能與CYP450基因和p53基因在生物體內(nèi)的主要功能及作用機(jī)制不同有關(guān)。不同的外源化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)后可引起氧化應(yīng)激、基因毒性應(yīng)激和蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激等反應(yīng)，從而激活生物細(xì)胞內(nèi)解毒代謝系統(tǒng)，以維持生物體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定[14]。而檢測(cè)參與這些反應(yīng)的各種解毒代謝酶類的響應(yīng)變化可部分反映外源污染物對(duì)生物的影響。環(huán)境污染物進(jìn)入生物體內(nèi)后，通常會(huì)在P450酶系的參與下，進(jìn)行氧化、還原、水解等代謝過程，使得污染物極性增加，導(dǎo)致污染物的毒性減弱[15]。海洋無脊椎動(dòng)物在有機(jī)污染物的I相代謝過程中產(chǎn)生大量副產(chǎn)物——活性氧，過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致生物體的氧化損傷[16-19]。CYP450酶系作為生物體內(nèi)的第一代謝階段酶,它通常將分子氧拆分成原子氧，并將其加入到底物中促使底物羥基化或環(huán)氧化，為第二階段的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)對(duì)外源物的轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，仿刺參CYP450基因的表達(dá)在3-甲基菲脅迫時(shí)受到抑制，在2-甲基蒽脅迫3 d和7 d后均受到抑制，而脅迫14 d后表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。因此，仿刺參CYP450基因的表達(dá)在不同多環(huán)芳烴脅迫下表現(xiàn)出不一致的變化規(guī)律。這與菲和3-甲基菲等對(duì)河鲀(Takifugurubripes)幼魚肝組織損傷的影響及多環(huán)芳烴類物質(zhì)對(duì)CYP450 1A1的誘導(dǎo)表達(dá)表現(xiàn)出相似的規(guī)律[2,21]。因此，推測(cè)短時(shí)間內(nèi)(7 d)2-甲基蒽誘導(dǎo)仿刺參CYP450基因的表達(dá)，調(diào)動(dòng)相關(guān)酶來抵抗毒性物質(zhì)的毒性作用，降低或減輕細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，但其調(diào)節(jié)能力有限，CYP450基因的表達(dá)不可能無限提高，當(dāng)隨著染毒時(shí)間的延長(14 d)，仿刺參受到的毒性作用超出其耐受性，其CYP450的合成體系受到損傷，使得CYP450基因的相對(duì)表達(dá)量下降，表現(xiàn)出中毒效應(yīng)。而CYP450基因?qū)?-甲基菲的耐受能力較強(qiáng)，在染毒期間持續(xù)表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。因此，多環(huán)芳烴類污染物3-甲基菲對(duì)仿刺參CYP450基因表達(dá)的影響小于2-甲基蒽。

p53基因是化學(xué)誘變物的主要攻擊位點(diǎn)，p53基因突變后，失去了對(duì)細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用。p53不僅本身參與機(jī)體DNA損傷的修復(fù)過程，它還作為多種細(xì)胞應(yīng)激于細(xì)胞應(yīng)答的中間環(huán)節(jié)，與其上下游的各種調(diào)控因子及其相關(guān)基因共同構(gòu)成了調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞應(yīng)答的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，仿刺參p53基因的表達(dá)在3-甲基菲脅迫時(shí)受到了抑制，在2-甲基蒽脅迫7 d時(shí)表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，而后(14 d)表現(xiàn)出顯著的抑制作用。正常組織中p53的表達(dá)水平很低,當(dāng)生物受到外界脅迫時(shí)，p53的表達(dá)水平明顯增加[23]。有研究報(bào)道，納米二氧化硅包被氧化錳能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和L929細(xì)胞中p53基因表達(dá)量升高[24]。因此推測(cè)，3-甲基菲在低濃度(c≤100 μg·L-1)短時(shí)間(t≤14 d)脅迫時(shí)沒有對(duì)仿刺參造成較強(qiáng)的毒害作用，而2-甲基蒽脅迫長時(shí)間(7 d)時(shí)對(duì)仿刺參產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，且仿刺參p53基因?qū)?-甲基蒽脅迫時(shí)間有一定的耐受閾值，當(dāng)脅迫時(shí)間大于此閾值后，可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡，致使p53基因相對(duì)表達(dá)量減少。

比較2種多環(huán)芳烴類污染物對(duì)仿刺參CYP450和p53基因的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在相同濃度和時(shí)間脅迫下，2種物質(zhì)對(duì)仿刺參CYP450和p53基因表達(dá)的影響作用總體趨勢(shì)為3-甲基菲<2-甲基蒽，這可能意味著由于二者結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異導(dǎo)致其作用機(jī)制不同。除濃度和時(shí)間外，化合物的結(jié)構(gòu)可能對(duì)其毒性有重要影響，需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

致謝：感謝大連海洋大學(xué)徐光景博士在文章修改中給予的幫助。