骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)老年大鼠髖部骨折后急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

王海斌 石利濤

(1遵化市人民醫(yī)院骨科，河北 遵化 064200；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科)

髖骨骨折患者中大多數(shù)為老年患者，通常首選手術(shù)治療〔1，2〕，但預(yù)后并不理想。有報(bào)道顯示，老年髖骨骨折患者手術(shù)后死亡率高達(dá)30%〔3，4〕。調(diào)查研究表明，老年髖骨骨折術(shù)后死亡危險(xiǎn)因素中臥床時(shí)間不是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，死亡的主因是骨折引起的肺部并發(fā)癥〔5〕，而目前對(duì)于這種情況缺乏有效治療手段。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中具有多向分化潛力和自我更新能力的干細(xì)胞，在一定條件下可向3個(gè)胚層的細(xì)胞分化〔6〕，其多向分化潛能會(huì)促進(jìn)組織再生，如肌肉、軟骨、脂肪等組織〔7〕。同時(shí)，由于BMSCs自身增殖能力強(qiáng)、分化廣，還具有免疫調(diào)節(jié)及修復(fù)受損組織等功能。當(dāng)發(fā)生肺部炎癥時(shí)，BMSCs向肺部聚集，參與肺組織的功能修復(fù)。但是，當(dāng)老年患者發(fā)生髖骨骨折并發(fā)肺損傷時(shí)，BMSCs是否也能起到相似作用尚不清楚。本研究以移植BMSCs進(jìn)行干預(yù)治療，觀察髖骨骨折后急性肺損傷的病理變化，探討B(tài)MSCs治療髖骨骨折并發(fā)肺損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1分組和建模 45只健康雄性SD老年大鼠(10月齡)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2015-0100，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究通過(guò)遵化市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查；所有大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成正常組(無(wú)任何處理)、模型組、治療組，每組15只。

建模方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打擊器上仰臥固定，左下肢置于砧板上拉直與水平面平行，標(biāo)記大鼠左側(cè)大粗隆位置，然后緊貼粗隆間放置打擊器鈍骨刀，使砝碼從20 cm處落下，造成左側(cè)髖骨骨折〔8〕。檢測(cè)觸及骨擦感和骨擦音被認(rèn)為造模成功。模型組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml生理鹽水，治療組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml BMSCs(2.5×106/ml)。

1.2主要試劑與儀器 倒置顯微鏡(Olympus公司)，骨折打擊器(自制)，組織勻漿機(jī)(上海天呈科技有限公司北京分公司)，切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec)；PE-CD90抗體、PE-CD45抗體、FITC-CD44抗體(美國(guó)e-BIOSCIENCE)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)，大鼠髓過(guò)氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(R&D 公司)；Toll樣受體(TLR)9多克隆抗體、核因子(NF)-κB多克隆抗體(購(gòu)自abcam公司)。

1.3大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 采用脫臼法處死SD大鼠(1月齡，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，離斷后肢轉(zhuǎn)移至無(wú)菌平皿中，去除附著肌肉，剪除股骨末端，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗髓腔收集骨髓。反復(fù)吹打成骨髓單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到離心管中，離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)液重懸，按1×105/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中孵育培養(yǎng)，每周換液3次，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.4BMSCs的鑒定 第三代BMSCs清洗、消化后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PBS重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×1012/L單細(xì)胞懸液；流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)：將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至取液管中，分別加入FITC-CD44、PE-CD90和PE-CD45一抗，充分混勻，離心3 000 r/min，37℃避光孵育，過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。

1.5肺組織損傷評(píng)分 建模后24 h，每組隨機(jī)取5只大鼠，4%多聚甲醛固定24 h，梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋固定，連續(xù)切片(厚度5 μm)。切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水，行蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)并拍照。對(duì)肺組織損傷進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)按無(wú)、輕、中、重，分別記為 0、1、2、3 分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺不張；(2)肺泡出血；(3)肺泡水腫；(4)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；(5)透明膜形成；(6)肺間質(zhì)水腫。高倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，取平均值即得肺組織損傷評(píng)分。

1.6肺組織干濕質(zhì)量比(W/D) 取大鼠右肺中葉組織稱重，然后放入60℃恒溫烤箱中3 d至恒重再稱重，兩次稱重之比為W/D值。

1.7肺組織中MPO及炎性因子TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠肺組織各100 mg，研碎后4℃下加裂解緩沖液裂解1 h，離心10 min取上清液，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明步驟操作。

1.8ELISA 檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置，離心10 min取血清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明步驟操作。

1.9Western印跡法檢測(cè)肺組織中TLR9、NF-κB蛋白水平 在肺組織(50 mg)中加1 ml裂解液，冰上勻漿，4℃離心10 min，經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)：制備5%濃縮膠及12%的分離膠。電泳：調(diào)解電壓至80 V，90 min后轉(zhuǎn)為100 V至溴酚藍(lán)跑至距分離膠底部0.5 cm時(shí)停止。轉(zhuǎn)膜：280 mA恒流1 h，結(jié)束后關(guān)閉電源取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現(xiàn)說(shuō)明轉(zhuǎn)膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱過(guò)夜。加二抗37℃ 2 h，結(jié)束后用TBST漂洗10 min×3次，后顯影。用 Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)定其吸光度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0 軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的形態(tài) BMSCs接種后6～8 h，懸浮的細(xì)胞開始貼壁，24 h貼壁基本完成；3 d后呈梭形或多角形；7 d后貼壁細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，整體呈螺旋形或漩渦狀(圖1)。

2.2BMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè) P3代大鼠BMSCs呈CD44+/CD90+/ CD45-，鑒定結(jié)果確認(rèn)為BMSCs，見圖2。

2.3肺組織病理學(xué)改變 正常組管壁無(wú)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺泡和間質(zhì)處發(fā)現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)肺泡間隔增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞；治療組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡和間質(zhì)處炎性改變減輕。見圖3。正常組肺組織損傷評(píng)分為(2.75±1.03)分，明顯低于模型組(7.42±1.55)分及治療組(5.80±1.34)分，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；治療組肺組織損傷評(píng)分也明顯低于模型組(P<0.01)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)志物

圖3 各組肺組織HE染色(×100)

2.4各組肺組織W/D 模型組肺組織W/D(6.50±0.51)明顯高于正常組(3.90±0.38)和治療組(4.70±0.44，均P<0.05)，治療組W/D并未恢復(fù)到正常水平。

2.5ELISA檢測(cè)肺組織中 MPO 及TNF-α、IL-6水平 模型組肺組織中MPO及TNF-α、IL-6水平明顯高于正常組(P<0.01)，而與模型組相比，治療組肺組織中 MPO、TNF-α、IL-6水平明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組肺組織MPO、TNF-α和IL-6水平

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

2.6各組血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組血清中TNF-α、IL-6水平較正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而治療組血清中TNF-α、IL-10水平較模型組明顯下降(P<0.01)，見表2。

2.7Western印跡檢測(cè)結(jié)果 模型組肺組織中TLR9(0.87±0.16)、NF-κB(1.10±0.14)蛋白表達(dá)水平較正常組(0.25±0.07，0.22±0.08)和治療組(0.58±0.14，0.65±0.16)明顯升高(P<0.01)；與正常組相比，治療組TLR9、NF-κB蛋白表達(dá)水平更高(P<0.01)。見圖4。

表2 各組血清中TNF-α、IL-6水平比較

圖4 Western印跡檢測(cè)各組肺組織中TLR9、NF-κB蛋白表達(dá)水平

3 討 論

髖骨骨折是老年患者常見的骨科疾病，也是其致殘、致死原因之一〔9〕。近年來(lái)，老齡化情況日益嚴(yán)重，老年人骨質(zhì)量及強(qiáng)度大幅下降，易發(fā)生骨質(zhì)疏松，摔倒等一些低能量損傷即可導(dǎo)致髖骨骨折，這對(duì)老年人生活、生存質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅〔10〕。有報(bào)道顯示，老年患者發(fā)生髖骨骨折后1年內(nèi)病死率高達(dá)30%，其中許多患者不能恢復(fù)至骨折前水平〔11〕。造成死亡率高的原因目前尚不清楚，也缺乏有效治療手段〔12〕。

BMSCs是可進(jìn)行體外培養(yǎng)的干細(xì)胞，在不同環(huán)境刺激下能參與組織再生、細(xì)胞分化〔13〕。同時(shí)，在不同周圍組織細(xì)胞和微環(huán)境的誘導(dǎo)下，BMSCs能參與免疫抑制過(guò)程，表達(dá)可溶性因子如趨化因子-2、白血病抑制因子等〔14，15〕。經(jīng)尾靜脈注射的 BMSCs可在體內(nèi)廣泛分布，但依然有傾向性，會(huì)優(yōu)先向受損、發(fā)炎組織遷移。BMSCs表面的抗原并不具有特異性，因此在BMSCs上并未發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)記分子〔16〕。所以，采用CD90、CD44陽(yáng)性表達(dá)，CD45陰性表達(dá)來(lái)鑒定BMSCs〔17〕。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明得到的細(xì)胞為BMSCs。

創(chuàng)傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，會(huì)使炎癥細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)，而肺組織中也出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞〔18〕。老年大鼠髖部骨折后，肺部管腔分泌物明顯增多，出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)尾靜脈注射BMSCs后，肺部分泌物、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示BMSCs可有效緩解髖部骨折所致急性肺部損害。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗感染等方面發(fā)揮著重要的作用〔19〕，但TNF-α表達(dá)過(guò)高則會(huì)引起休克、發(fā)熱等反應(yīng)；IL-6是趨化因子家族中的細(xì)胞因子，能與其他細(xì)胞因子結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用，參與機(jī)體發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等，是機(jī)體炎癥狀態(tài)的指標(biāo)之一〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，髖部骨折會(huì)導(dǎo)致老年大鼠出現(xiàn)急性肺損傷及全身炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為外周血及肺內(nèi)TNF-α、IL-6水平升高；BMSCs可以通過(guò)平衡炎癥反應(yīng)達(dá)到減輕急性肺損傷的作用。

TLR被證實(shí)是一類識(shí)別型受體家族，在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(VALI)中起到重要作用。國(guó)外報(bào)道，在VALI研究中發(fā)現(xiàn)TLR家族中的TLR4和TLR9表達(dá)水平均明顯上調(diào)〔21〕。在急性肺損傷發(fā)生過(guò)程中，TLR被激活，同時(shí)活化NF-κB信號(hào)通路，而后者的活化可釋放炎性細(xì)胞因子，如IL-6和TNF-α等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展〔22〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs抑制了建模后大鼠肺組織中TLR9及NF-κB蛋白表達(dá)水平，同時(shí)肺組織和血清中TNF-α、IL-6含量明顯下降，提示BMSCs減輕了建模后的肺病理性損傷程度，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致〔23〕。BMSCs移植能減輕大鼠肺損傷，降低炎性因子，可能成為急性呼吸窘迫綜合征和肺損傷的潛在細(xì)胞治療方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了髖骨骨折能夠?qū)Ψ尾吭斐杉毙該p傷，而通過(guò)尾靜脈途徑注射BMSCs能有效減輕骨折后急性期肺部炎癥及由此導(dǎo)致的肺損傷，從而為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。