芯片捕獲二代測序技術(shù)在新生兒疾病篩查中的應(yīng)用*

王欣，孫云，王彥云，洪冬洋，管賢偉，蔣濤，許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院&南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心，南京 210004)

新生兒疾病篩查指在新生兒期對某些危害嚴(yán)重的遺傳代謝性疾病、先天性疾病進(jìn)行群體篩查，以早期診斷和治療，從而避免或減輕疾病帶來的危害[1]。傳統(tǒng)的生化篩查受限于檢測方法，檢測病種有限，且假陽性率較高，甚至存在漏篩[2-3]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于基因檢測的新生兒疾病篩查方法價值凸顯[4]。本研究初步設(shè)計169種常見且危害嚴(yán)重的新生兒疾病組合，利用芯片捕獲二代測序技術(shù)對150例干血濾紙片樣本進(jìn)行檢測，以期為臨床開展基因篩查積累經(jīng)驗。

1 對象和方法

1.1研究對象 由南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)中心新生兒篩查室隨機(jī)收集2021年1月至8月南京地區(qū)出生的新生兒干血濾紙片樣本共150例，其中串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)初篩陽性樣本98例，初篩陰性樣本52例。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(No.2021KY-071)，所有新生兒家屬均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 NanoDrop分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，Covaris LE220超聲破碎儀(美國Covaris公司)，Agilent 2100 生物分析儀(美國Agilent公司)，MGISEQ-2000高通量測序儀(深圳華大智造科技公司)，ABI Prism 3500XL高通量基因分析儀(美國Thermo Fisher公司)。QIAamp血液DNA提取試劑盒(批號：51185，北京天根生化科技公司)，高保真DNA聚合酶(Phanta Max Master Mix)、打斷酶(VAHTS Universal Plus Fragmentation Module) 購自南京諾唯贊公司，PCR純化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 按照QIAamp血液DNA提取試劑盒說明書提取干血斑中基因組DNA，NanoDrop分光光度計測量DNA樣本濃度。用于后續(xù)實驗的DNA濃度≥1.6 ng/μL，剩余DNA樣本置于-20 ℃保存。

1.3.2基因篩查Panel設(shè)計 新生兒疾病篩查病種的選擇嚴(yán)格參照世界衛(wèi)生組織(WHO)新篩病種準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)[5]，包括：(1)疾病危害嚴(yán)重，早期癥狀可能不明顯；(2)有一定發(fā)病率，不及時干預(yù)預(yù)后不良；(3)篩查疾病可治療；(4)適合大規(guī)模開展。Panel涵蓋臨床常見遺傳病共169種，包括耳聾24種(氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)性耳聾、常染色體隱性耳聾等)、氨基酸代謝病21種(苯丙氨酸羥化酶缺乏癥、四氫生物蝶呤缺乏癥等)、有機(jī)酸代謝病18種(甲基丙二酸血癥、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥等)、糖代謝病16種(糖原累積病、半乳糖血癥等)、脂質(zhì)代謝障礙11種(短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥等)、溶酶體貯積癥13種(法布雷病、尼曼-匹克病A/B型等)、血液系統(tǒng)疾病8種(α地中海貧血、β地中海貧血等)、骨骼神經(jīng)系統(tǒng)疾病12種(杜氏肌營養(yǎng)不良、脊髓型肌萎縮癥等)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病13種(11-β-羥化酶缺乏性先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、17-α羥化酶缺乏性先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥等)、免疫缺陷病10種(常染色體隱性重癥聯(lián)合免疫缺陷、X連鎖淋巴增殖綜合征等)、其他代謝病13種(肝豆?fàn)詈俗冃浴⒓易逍愿吣懝檀佳Y1型等)以及其他遺傳病10種(Gitelman綜合征、Leber遺傳性視神經(jīng)病變等)，對應(yīng)的致病基因共計172個。

1.3.3芯片捕獲二代測序 利用二代測序技術(shù)對致病基因的所有編碼區(qū)進(jìn)行捕獲測序。利用打斷酶將提取質(zhì)控合格的基因組DNA均一化后打斷成100～500 bp 的DNA小片段。通過磁珠雙選分離200～250 bp的DNA片段，雙選后進(jìn)行接頭連接和產(chǎn)物純化，對純化后的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和純化，經(jīng)TE回溶后完成DNA文庫構(gòu)建。文庫經(jīng)BMG進(jìn)行片段濃度檢測，質(zhì)控合格后，可用于雜交。利用定制的IDT xGen 探針對目標(biāo)區(qū)域序列進(jìn)行捕獲，將雜交文庫進(jìn)行pooling、定量；然后將pooling文庫進(jìn)行單鏈環(huán)化和滾環(huán)復(fù)制，環(huán)化后的文庫在制得 DNA納米球后，利用MGISEQ-2000高通量基因測序儀進(jìn)行測序，測序類型為PE100+10，測序完成后，得到原始測序數(shù)據(jù)。核基因組有效測序深度≥100×，線粒體基因有效測序深度≥300×，目標(biāo)區(qū)域的20×覆蓋度≥95%。

1.3.4生物信息學(xué)分析 利用Illumina bcl2fastq軟件將原始高通量測序數(shù)據(jù)從Bcl格式轉(zhuǎn)換為Fastq格式。在過濾低質(zhì)量讀數(shù)后，測序讀數(shù)與NCBI人類參考基因組(hg19/GRCh37)對齊。健康人群中變異位點的頻率來自dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、1000基因組計劃(1000 Genome Project)(http://browser.1000genomes.org)和外顯子組聚合聯(lián)盟(Exome Aggregation Consortium, ExAC) (http://exac.broadinstitute.org/)。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會 (American College of Medical Genetics, ACMG)[6]的指南和基于支持致病性的證據(jù)水平的文獻(xiàn)[7-9]搜索解釋變異。通過 OMIM (http://www.omim.org)、ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar) 和 Human Gene變異數(shù)據(jù)庫 (http://www.hgmd.org)等數(shù)據(jù)庫確定致病基因和致病位點并將其與疾病相關(guān)聯(lián)。SIFT (http://sift.jcvi.org)、Variant Taster (http://www.varianttaster.org)、PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和PROVEAN( http://provean.jcvi.org/index.php)等軟件用于預(yù)測受變異影響的生物學(xué)功能。

1.3.5Sanger測序驗證 采用特定引物擴(kuò)增DNA目標(biāo)區(qū)域，利用Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物和1 μL 6×DNA loading buffer混勻，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，驗證PCR產(chǎn)物大小及質(zhì)量(條帶單一，無引物二聚體)。利用PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，采用ABI Prism 3500XL高通量基因分析儀進(jìn)行測序和分析。

2 結(jié)果

2.1可疑患者檢出情況 150例樣本中共檢出4例可疑患病，陽性率為2.67%(4/150)，涉及疾病分別為氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)性耳聾1例，常染色體隱性遺傳耳聾1例，α地中海貧血1例，高脯氨酸血癥Ⅰ型1例，患者具體臨床情況見表1，Sanger驗證結(jié)果見圖1。其中，高脯氨酸血癥Ⅰ型病例的串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果為脯氨酸(Proline)：482.08 μmol/L (參考區(qū)間：86～330 μmol/L)，該例患兒家長拒絕召回復(fù)查。

表1 可疑患者情況

注：箭頭標(biāo)注變異所在位置或起始位置及堿基。

2.2致病基因攜帶情況 共檢出88例致病基因攜帶者，致病基因攜帶率為58.67%(88/150)，在致病基因攜帶者中，攜帶有1個致病基因變異的樣本數(shù)高達(dá)40.7%(61/150)，最多可見攜帶有4個不同的致病基因變異，占0.7%(1/150)。對于已檢出可能患有某疾病的4例可疑患者，發(fā)現(xiàn)仍攜帶其他基因的致病變異(表2)。排除可疑患者后，攜帶頻率最高的為耳聾基因GJB2和SLC26A4，其次分別是PAH、SLC22A5、DUOX2、SLC12A3、USH2A、ACADS基因(表3)。其余58例未檢測出致病基因變異。

表2 致病基因攜帶數(shù)

續(xù)表

表3 致病基因攜帶情況

2.3與傳統(tǒng)生化篩查(串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù))檢出率對比 在病種相同情況下，基因篩查150例中篩查出可疑陽性1例并確診，初篩陽性率為0.66%，陽性預(yù)測值為100%。當(dāng)擴(kuò)展至169個遺傳病病種時，可疑陽性4例，并通過Sanger測序法明確診斷，即初篩陽性率為20%，陽性預(yù)測值為100%。

3 討論

本研究通過對150例回顧性樣本檢測，最終檢出4例可疑陽性患者(常染色體隱性遺傳耳聾1例，α地中海貧血1例，高脯氨酸血癥Ⅰ型1例及氨基糖苷類藥物誘導(dǎo)性耳聾1例)；檢出88例致病基因攜帶者。攜帶頻率最高的致病基因為GJB2和SLC26A4，其次是PAH、SLC22A5、DUOX2、SLC12A3、USH2A及ACADS，致病基因攜帶率與臨床患病率一致。篩查病種從傳統(tǒng)生化篩查約40種遺傳代謝病拓展至169種，篩查病種的拓展能夠盡早發(fā)現(xiàn)患兒并及時給予干預(yù)，也為罕見病的流行病學(xué)研究提供了有效信息，為臨床診斷與治療提供研究群體及實驗依據(jù)。

國內(nèi)基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的傳統(tǒng)生化篩查初篩陽性率約為1.88%～4.02%，陽性預(yù)測值約為1.05%～2.68%[10-11]。在本研究的150例樣本中，傳統(tǒng)篩查初篩陽性樣本(指標(biāo)高于篩查截斷值)共98例，最終僅確診1例高脯氨酸血癥患兒，陽性預(yù)測值為1.02%。在病種相同的情況下，150例樣本基因篩查的初篩陽性率為0.66%，陽性預(yù)測值高達(dá)100%。傳統(tǒng)生化篩查易受多因素影響，初篩假陽性率較高[12]，召回人數(shù)眾多造成篩查成本增加，且產(chǎn)婦及家屬易產(chǎn)生不必要的心理負(fù)擔(dān)。而基因篩查基于遺傳學(xué)基礎(chǔ)明確基因變異信息，能夠從源頭上排除假陽性，有效降低篩查假陽性率，提高陽性預(yù)測值，同時，減少不必要的召回，進(jìn)而縮短診斷周期?？紤]到本研究樣本數(shù)量有限，仍需進(jìn)一步累積樣本量對該初步結(jié)論進(jìn)行深入驗證。

筆者對基因篩查的臨床應(yīng)用尚有幾點思考。(1)對于檢測方法的選擇。本研究采用的是芯片捕獲二代測序方法，除該方法外，還有多重PCR富集二代測序法、外顯子組測序法以及全基因組測序等可供選擇[13]。多重PCR富集二代測序成本較低[14]，但受限于多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，將上百個基因的全部編碼區(qū)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增較為困難，更適用于熱點突變的檢測，而熱點突變的檢測容易造成致病位點的遺漏。外顯子測序與全基因組測序檢測位點較為全面，但成本過高，操作復(fù)雜，檢測周期長，且對于意義未明突變位點的解讀較為復(fù)雜[15]，不適用于新生兒篩查項目。因此，筆者認(rèn)為芯片捕獲二代測序方法成本低廉，操作較簡單，檢測周期適中[16]，更適用于新生兒篩查。(2)篩查方案的選擇，即基因篩查作為一線篩查方案還是二階篩查。二階篩查是針對傳統(tǒng)篩查檢出的初篩陽性樣本，利用原血片進(jìn)行基因篩查。許多疾病尚缺乏生化篩查的標(biāo)志物，如地中海貧血、耳聾等，因此具有較多病種的漏篩風(fēng)險。作為一線篩查，目前的基因篩查項目僅判讀已報道的致病變異及可疑致病變異。在臨床表型不明確的前提下，對意義未明變異位點致病性的解讀較為復(fù)雜。因此，將基因篩查與傳統(tǒng)生化篩查相結(jié)合，在基因型和表型2個層面進(jìn)行評估，則可在提高檢出率的同時也可避免臨床風(fēng)險，目前可能是更合適的臨床方案。(3)已有研究報道的基因篩查項目納入病種不盡相同[17-18]，與疾病存在地域或人種的差異以及部分疾病的發(fā)病率、干預(yù)效果未知等有關(guān)。發(fā)病率是根據(jù)臨床診斷的患者數(shù)及該地區(qū)嬰兒出生數(shù)統(tǒng)計獲得，往往會低估發(fā)病率。本研究中，150例樣本中有2例囊性纖維化致病基因攜帶者，提示許多尚未有流行病學(xué)報道的疾病在我國有一定的發(fā)病率。隨著研究的深入，基因篩查病種組合也會隨之調(diào)整和完善，進(jìn)而完善相應(yīng)疾病的流行病學(xué)信息。(4)新生兒基因篩查還應(yīng)注意倫理學(xué)問題，尤其是對于篩查陽性家庭成員的遺傳咨詢、心理疏導(dǎo)也很重要。

新生兒基因篩查是出生缺陷防治領(lǐng)域的嶄新課題，國內(nèi)外零星報道均處于研究階段，尚未真正轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。本研究僅為初步探索，納入樣本較少，研究結(jié)果較為受限，但已可初步反映出基因篩查的重要臨床價值和應(yīng)用前景，有待進(jìn)一步深入積累和探索。