花生發(fā)芽過程中基礎(chǔ)成分變化及白藜蘆醇的誘導(dǎo)富集

詹玉婷 趙文瑞 陳志剛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095)

花生(ArachishypogaeaL.)，豆科落花生屬植物，因其種植范圍廣、品質(zhì)優(yōu)良而成為世界重要的經(jīng)濟作物之一[1]?；ㄉ鸂I養(yǎng)豐富，營養(yǎng)素較為全面，不僅含有大量的脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，糖類等基本的營養(yǎng)物質(zhì)，同時含有多種維生素，無機鹽等，同時，花生中含有的白藜蘆醇、精氨酸、酚酸、黃酮類和植物甾醇等生物活性物質(zhì)也是其他雜糧所少有的[2, 3]?；ㄉ母哂停叩鞍?，高營養(yǎng)特性，使其成為繼大豆后又一國際植物資源研究開發(fā)的新熱點。

白藜蘆醇(Resveratrol，以下簡稱Res)，非黃酮類多酚化合物，學(xué)名3,4,5-三羥基二苯乙烯，又名芪三酚，廣泛存在于虎杖、葡萄、花生等多種植物中[4]。由于其具有抗氧化、抗病毒、抗炎保肝、預(yù)防心血管疾病等生物活性[5-7]，在食品、醫(yī)藥、植物生理等領(lǐng)域受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注?；ㄉ鳛樘烊籖es的重要來源之一，因其價格低廉，種植方便而成為熱門的研究原料。在植物體內(nèi)，白藜蘆醇是其受到病原菌侵染或其他環(huán)境因子刺激時誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然活性成分，因此外界的刺激誘導(dǎo)是提高植物中Res含量的有效手段，近些年，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量關(guān)于白藜蘆醇誘導(dǎo)方式的研究。誘導(dǎo)方式可分為生物誘導(dǎo)和非生物誘導(dǎo)，其中，非生物誘導(dǎo)處理簡單快速，主要有超聲、紫外等物理損傷處理和添加苯丙氨酸、水楊酸等化學(xué)誘導(dǎo)劑處理。超聲因空化效應(yīng)而具有強大的外力沖擊，這可以增加植物細胞次生代謝產(chǎn)物的生物合成，膜滲透性，并改變細胞形態(tài)。超聲處理使紅豆杉細胞培養(yǎng)中紫杉醇含量增加3倍[8]，Yu等[9]發(fā)現(xiàn)超聲處理后發(fā)芽3d反式白藜蘆醇含量能高達對照組的3.34倍。紫外能夠提高植物體內(nèi)促進刺激次生代謝物的酶含量[10]，Cho等[11]發(fā)現(xiàn)紫外能將葡萄中白藜蘆醇的含量從8.99μg/g提高到10.56μg/g。信號分子水楊酸在植物響應(yīng)外界刺激過程中起著重要作用，是植物獲得性抗性反應(yīng)基因的誘導(dǎo)因子[12]。Chung等[12]研究中發(fā)現(xiàn)花生葉浸入無菌水楊酸后，白藜蘆醇的含量增加3倍。苯丙氨酸是白藜蘆醇合成反應(yīng)的前體物質(zhì)，姜豐[13]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的苯丙氨酸能將葡萄皮愈傷組織中白藜蘆醇的含量提高至對照組的2.1倍。另外，低溫也是植物體常見的環(huán)境損傷，植物受到低溫刺激后可以積累體內(nèi)調(diào)節(jié)物質(zhì)如脫落酸來提高自身的抗性[14]，但目前沒有關(guān)于低溫脅迫對植物體體內(nèi)白藜蘆醇的含量影響。同時，關(guān)于上述幾種誘導(dǎo)方式對多種花生品種富集效果的比較研究也較少。

發(fā)芽是一種能改善種子營養(yǎng)品質(zhì)和生物利用率的有效手段，在生活和科研中都得以廣泛利用[15, 16]。在發(fā)芽過程中種子休眠狀態(tài)被打破、各種內(nèi)源酶被激活、花生中的營養(yǎng)物質(zhì)含量也發(fā)生改變[17-19]。因此，本研究主要探究發(fā)芽過程中花生種子營養(yǎng)成分和活性成分Res的變化，并合理選取營養(yǎng)含量均衡、Res含量較高的花生品種，進一步考察比較低溫、超聲、紫外、添加苯丙氨酸和水楊酸對多種花生種粒中白藜蘆醇的富集效果，為富含白藜蘆醇的功能性花生產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

花生種子：市售，HY22：花育22；HY23：花育23；HY25：花育25；HY33：花育33；HY36：花育36；HY39：花育39；HY50：花育50；HN12：河南開封自種種子；反式Res標品(純度≥98%，EP)；石油醚(沸程30～60℃，AR)。

SZF-06A型脂肪測定儀；FD-2KW可調(diào)封閉電爐；馬弗爐(KSW-4D-11型電阻爐溫度控制器和SX2-1-10型高溫箱形電爐)；Hanon K1160型全自動凱氏定氮儀；UV BlueStar A型紫外可見分光光度計；UP型超聲清洗儀；島津LC-20A型高效液相色譜。

1.2 花生種子發(fā)芽工藝

挑選大小一致、成熟飽滿的花生種子，用蒸餾水洗去表面浮塵，0.5%的次氯酸鈉浸泡消毒15min后，用滅菌后的去離子水反復(fù)沖洗3遍，25℃恒溫浸泡8h，置于植物生長箱中避光發(fā)芽4d，發(fā)芽溫度30℃，濕度為100%，每隔24h取樣，每隔12h換水，鮮樣用于測定芽長和基礎(chǔ)成分，用作Res測定的樣品儲藏在-20℃。

1.3 基礎(chǔ)成分的測定方法

芽長的測定：用軟尺測量并記錄；發(fā)芽率的測定：每隔24h計數(shù)并記錄(SN/T0800.14—1999)；根據(jù)AACC測定方法，粗脂肪、粗灰分、粗蛋白的測定分別采用索氏抽提法、灼燒法、凱氏定氮法；可溶性蛋白、游離氨基酸、總糖的測定分別采用考馬斯亮藍法，茚三酮法，苯酚硫酸法[20]?；A(chǔ)成分含量均以干重計量。

1.4 白藜蘆醇的提取測定

1.4.1白藜蘆醇的提取

準確稱取凍干脫脂后的樣品5g，加入80%乙醇50mL，在50℃超聲輔助提取時間40min，冷卻后離心(6000r/min，10min，4℃)，收集離心后上清液于燒瓶中，沉淀按上述操作再重復(fù)提取后，合并上清液，50℃真空濃縮至干，加入甲醇溶液后超聲輔助溶解，提取液定容至5mL。所有實驗操作均在避光下進行。

1.4.2色譜條件

參照Lee等[21]的方法并加以改進，色譜柱：150mm×4.6mm，5μm；流動相：乙睛∶水=1∶2(含0.09%冰醋酸)，通過0.45μm的濾膜并脫氣；流速：1mL/min；紫外檢測器：波長306nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。Res含量以干重計。

1.5 誘導(dǎo)處理

對照組：按1.2所述進行正常發(fā)芽培養(yǎng)。低溫誘導(dǎo)：花生樣品在浸泡過程中每隔4h放置在4℃環(huán)境中1h，在發(fā)芽過程中每隔24h放置低溫下1h。超聲誘導(dǎo)：花生在浸泡過程中每隔4h超聲(240W，25℃)30min，發(fā)芽過程中每24h超聲誘導(dǎo)30min。紫外誘導(dǎo)：花生在浸泡過程中每隔4h分別紫外燈(UV-C)下照射20min，發(fā)芽過程中每24h紫外照射20min。水楊酸誘導(dǎo)：在浸泡以及發(fā)芽過程中用2mmol/L水楊酸代替蒸餾水。苯丙氨酸誘導(dǎo)：在浸泡以及發(fā)芽過程中用0.4mmol/L苯丙氨酸代替蒸餾水。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各組實驗均設(shè)3組重復(fù)，實驗結(jié)果均以均值±標準差表示，采用Microsoft Excel對數(shù)據(jù)進行整理計算，采用Origin8.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生發(fā)芽過程中發(fā)芽率和芽長的變化

在發(fā)芽4d的過程中，記錄各品種的發(fā)芽率和芽長，結(jié)果表明，發(fā)芽率和芽苗長度均隨著發(fā)芽時間的延長而迅速增加(表1，表2)。在發(fā)芽1d時，所有品種的發(fā)芽率都能達到70%以上，芽苗長度均能達到0.3cm以上，而發(fā)芽4d時，所有品種的發(fā)芽率均能超過75%，芽苗長度均能超過2cm。由不同品種間發(fā)芽率以及芽苗長度的顯著性差異分析可以看出，HN12、HY23、HY39、HY25生長狀況相對較好，在發(fā)芽1d時發(fā)芽率均達到90%以上，芽苗長度分別為0.65、0.64、0.56、0.55cm，而發(fā)芽4d時發(fā)芽率均能達到95%以上，芽苗長度分別為3.07、3.02、2.79、2.91cm。

表1 各品種發(fā)芽4 d的發(fā)芽率變化

注：同一列中字母不同代表有顯著性差異，P<0.05，余同。

表2 各品種發(fā)芽4 d的芽長變化

2.2 花生發(fā)芽過程中基礎(chǔ)成分含量的變化

對不同品種花發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分的變化情況進行探究，結(jié)果表明，各品種營養(yǎng)成分在發(fā)芽過程中的含量有所差異，但發(fā)芽過程中的變化趨勢一致(圖1)。

各個品種在發(fā)芽過程中的灰分含量基本保持不變，集中在2.3%～2.6%之間，說明發(fā)芽對花生中的礦物質(zhì)含量基本不產(chǎn)生影響(圖1a)。

各個品種的粗脂肪含量在發(fā)芽過程中均呈明顯的降低趨勢(圖1b)，未發(fā)芽時，含量集中在50%～55%之間，發(fā)芽1～2d時，脂肪含量降低緩慢，發(fā)芽3～4d，大部分品種的脂肪含量降低迅速，發(fā)芽4d后各品種花生脂肪含量降低了65%～23%。這可能是由于花生在發(fā)芽過程中，脂肪酶被激活[22]，種子中貯藏的脂肪開始降解，生成的脂肪酸等物質(zhì)參與油料種子萌發(fā)時活躍的乙醛酸循環(huán)，為芽苗的生長發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)[23, 24]。在其他種子如大豆[25]、芝麻[26]發(fā)芽過程中脂肪含量也存在逐漸降低的變化規(guī)律。

通過研究各個品種花生發(fā)芽4d過程中粗蛋白，可溶性蛋白，游離氨基酸的含量變化可以觀察到各品種發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)的變化規(guī)律。發(fā)芽過程中，各品種的粗蛋白含量基本維持不變，可溶性蛋白含量呈總體呈降低趨勢，游離氨基酸含量呈明顯的升高趨勢(圖1c～圖1e)。其中，總蛋白質(zhì)含量較高的HY50，未發(fā)芽時蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為25.96%，可溶性蛋白含量為19.37%，游離氨基酸含量為11.79mg/g，發(fā)芽4d后蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為25.63%，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)為9.88%，游離氨基酸含量為22.09mg/g。粗蛋白是以含氮化合物為基礎(chǔ)進行測定的，粗蛋白含量變化幅度不大說明發(fā)芽過程中總的氮物質(zhì)含量基本保持不變，可溶性蛋白含量降低，游離氨基酸含量不斷升高可能是因為蛋白酶在發(fā)芽過程中被激活[27]，可溶性蛋白逐漸被分解為小分子的氨基酸[28, 29]，從而發(fā)芽花生中的可溶性蛋白含量減少，游離氨基酸含量增多。

在花生發(fā)芽過程中，總糖含量變化幅度均較小，質(zhì)量分數(shù)維持在10%～15%，變化趨勢因品種不同而有所差異(圖1f)。

2.3 花生發(fā)芽過程中白藜蘆醇含量的變化

圖2 花生發(fā)芽4 d過程中白藜蘆醇含量的變化

各個樣品在發(fā)芽前的Res含量很低， 均在4.42～20.01μg /100g之間(圖2)。發(fā)芽后，各品種的Res含量顯著增加，Res含量總體呈上升趨勢，但各品種的變化趨勢不同。其中，HY22、HY23、HY25、HY50、HN12在發(fā)芽4d的過程中呈先升高后降低再升高的趨勢，HY22在發(fā)芽第2d Res的含量達到峰值，是未發(fā)芽的15.1倍。HY23、HY25、HY50、HN12在發(fā)芽第4d Res的含量達到峰值，分別為未發(fā)芽的7.5、31.1、11.1、13.0倍。HY36、HY39Res的含量先增加后降低，并分別于第2d達到峰值，分別是未發(fā)芽的9.1、4.9倍。HY33的變化呈波動的趨勢，但Res的含量總體上顯著增加，并在第4d達到最大值，是未發(fā)芽的2.7倍。由此可見，發(fā)芽能顯著增加花生中Res的含量，而Res的變化規(guī)律因品種不同會有較大的差異。有研究表明，植物可以在一系列酶的作用下，通過苯丙烷途徑合成Res，在此過程中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和Res合成酶(RS)發(fā)揮了最重要的作用[6]。在本研究中，所有品種的Res含量均顯著高于未發(fā)芽時的樣品，這可能是因為種子萌發(fā)是一個激活內(nèi)源酶的過程，在發(fā)芽過程中RS或PAL可能被激活，更多的Res被合成。

2.4 不同誘導(dǎo)方式對花生中白藜蘆醇含量的影響

由圖2知，各品種花生中的Res在發(fā)芽2d已經(jīng)達到較高的含量，因此，在本研究中，結(jié)合發(fā)芽過程中各花生品種的生長狀況、基礎(chǔ)成分含量、Res含量的變化，選取生長較好、營養(yǎng)均衡、Res含量相對較高的3個品種HY22、HY25、HY50，在發(fā)芽的基礎(chǔ)上，進一步采用不同誘導(dǎo)方式進行處理，研究發(fā)芽2d時對Res的富集效果(圖3)。

各處理方式對白藜蘆醇的富集效果因品種而異，未進行誘導(dǎo)處理時，HY22、HY25、HY50中發(fā)芽2d時Res的含量分別為99.36、66.16、80.24μg/100g，超聲處理對3個品種的Res的富集作用最為明顯，超聲處理后，HY22、HY25、HY50Res含量分別是對照組的1.3、2.0、1.7倍。紫外處理后，HY22、HY25、HY50Res含量分別是未處理組的1.3、2.2、1.4倍。低溫處理僅對HY25的Res有一定的富集效果，處理后Res含量是對照組的1.4倍，而低溫處理后HY22、HY50的Res含量明顯比未處理組低。經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)劑苯丙氨酸處理后，發(fā)芽2d的HY22、HY25、HY50的含量分別是對照組的1.2、1.6、1.7倍。添加水楊酸處理僅對HY50中的Res有一定的富集效果，添加水楊酸后的HY50中的Res的含量是對照組的1.4倍，而HY22、HY25Res的含量明顯降低。由此可見，在發(fā)芽過程中，超聲、紫外以及添加苯丙氨酸對3個品種中Res的含量均有較好的富集效果，可能是因為在發(fā)芽基礎(chǔ)上中，超聲、紫外和苯丙氨酸均能提升3個品種花生內(nèi)部PAL和RS的活性[30-32]。

注：P<0.01。

3 結(jié)論

花生芽作為一種營養(yǎng)全面的新型健康食品，相對于花生種子本身不僅在口感上發(fā)生了明顯的改變，在營養(yǎng)品質(zhì)上也有了顯著的改善，在發(fā)芽過程中，隨著芽苗的生長，大分子營養(yǎng)物質(zhì)脂肪、可溶性蛋白減少，小分子的游離氨基酸含量增加，對人體有益的活性成分Res含量增加，粗蛋白含量、總糖含量和灰分含量沒有發(fā)生顯著變化。在發(fā)芽基礎(chǔ)上，采取超聲、紫外以及添加化學(xué)誘導(dǎo)劑苯丙氨酸3種方式對篩選出的HY22、HY25、HY50花生中的Res均有較好的誘導(dǎo)富集作用，且誘導(dǎo)效果因品種不同而異，超聲、紫外誘導(dǎo)的方式對HY25的誘導(dǎo)效果最好，化學(xué)誘導(dǎo)劑苯丙氨酸對HY50的誘導(dǎo)效果最好。