雙指標(biāo)評(píng)價(jià)核桃蛋白酶法增溶改性

張 汆 劉 洋 陳志宏 儲(chǔ)晶晶 何曉偉

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，滁州 239000)

核桃(JuglansRegiaL.)屬胡桃科植物，其種子與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”。核桃自漢代傳入中國(guó)，2010年中國(guó)核桃種植面積及總產(chǎn)量超越美國(guó)， 2017年，中國(guó)核桃產(chǎn)量為189萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)47%，居世界第一[1]。核桃仁中含有豐富的油脂(65%～70%)、蛋白質(zhì)(14.6%～19.0%)、碳水化合物(5.4%～10.0%)、磷脂、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)組分[2-3]。核桃油中不飽和脂肪酸含量豐富，如，油酸11.5%～25%、亞油酸50%～69%、亞麻酸6.5%～18%等總量90%以上，是一種高檔、保健型的膳食油脂[4-6]。

脫脂后的核桃餅粕是優(yōu)質(zhì)的膳食蛋白資源，其中蛋白質(zhì)以水不溶性的谷蛋白(70.11%)和醇溶蛋白(5.33%)為主[3,7]。由于核桃蛋白中75%以上的都是水不溶性蛋白質(zhì)，使其分離提取和在食品中的應(yīng)用受到限制，因此，如何有效提取核桃餅粕中的蛋白質(zhì)、提高其溶解性是核桃蛋白研究的主要內(nèi)容。

目前，脫脂核桃餅粕中蛋白質(zhì)的分離提取方法多為酶法，這方面的研究報(bào)道很多，所用的酶主要有：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等[8-12]。利用酶法水解脫脂核桃餅粕制備各種核桃肽是目前的研究熱點(diǎn)[10]。肽類易吸收、有一定保健功效，但是分子量較小的肽類不僅不易保存，易被氧化、易吸濕、潮解，而且喪失了蛋白質(zhì)的一些功能性質(zhì)，如黏度、起泡性、乳化性等[13，14]。因此，為了獲得一種既能提高核桃蛋白溶解度，又能保持其作為大分子功能特性的方法，本研究在分析木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)脫脂核桃粉中蛋白質(zhì)水解的基礎(chǔ)上，選擇一種復(fù)合酶解方法，可明顯提高核桃蛋白的溶解性，為核桃蛋白在食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

部分脫脂核桃粉，食品級(jí)。

磷酸鹽、水合茚三酮、氯化亞錫等，均為分析純?cè)噭?/p>

耐高溫α-淀粉酶(4萬(wàn)U/g，食品級(jí))，木瓜蛋白酶(200萬(wàn)U/g)、菠蘿蛋白酶(120萬(wàn)U/g)、風(fēng)味蛋白酶(80萬(wàn)U/g)。

1.2 主要儀器設(shè)備

DHS16-A型水分測(cè)定儀，1601160S型杜馬斯燃燒儀，T6型可見分光光度計(jì)，LG-10B型真空冷凍干燥機(jī)，A300型全自動(dòng)氨基酸分析儀，YRE-301型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

脫脂：將部分脫脂的核桃粉粉碎(過(guò)60目篩)，以石油醚(30～60 ℃)為脫脂溶劑，采用索氏脂肪提取儀連續(xù)脫脂處理6～8 h后，揮發(fā)有機(jī)溶劑后，即可得到脫脂核桃粉(Defatted walnut flour，DWF)。

去淀粉：將DWF與水按1 ∶10比例混合攪拌，經(jīng)過(guò)95 ℃水浴加熱糊化15 min，取出、降溫至50～60 ℃時(shí)，加入1.5%耐高溫α-淀粉酶，水解2 h后，95 ℃滅酶(20 min)、離心(4 000 r/min，5 min)，沉淀水洗2～3次，最后冷凍干燥、粉碎(過(guò)60目篩)，此為脫脂脫淀粉核桃粉(Defatted and destarch walnut flour，DDWF)，備用。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)組分分析

常規(guī)組分分析：水分，采用直接干燥法(GB/T-9695.15—2008)測(cè)定；脂肪，索氏提取法(GB.5009.6—2016)測(cè)定；蛋白質(zhì)，杜馬斯燃燒法(GB 5009.5—2008)測(cè)定；灰分，馬弗爐直接灰化法 (GB 5009.4—2016)測(cè)定；淀粉含量：采用酸水解法(GB 5009.9—2016)。

氨基酸組分：采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定[2]。

水解度(Degree of hydrolysis，DH，%)：采用茚三酮比色法測(cè)定[15-16]。采用茚三酮比色法測(cè)定酶解液中游離氨基酸含量，然后按照以下公式計(jì)算DH：

式中：m1為酶解液中游離氨基酸含量，g；m2為樣品質(zhì)量，g；p為樣品中蛋白質(zhì)含量，g/100 g。

可溶性固形物含量(Soluble solids，SS)：采用直接干燥法測(cè)定[17]。酶解結(jié)束后，滅酶，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，用去離子水定容至100 mL，混勻，吸取5.0 mL，放入干凈鋁盒內(nèi)，在105 ℃下干燥至恒重。取出，在干燥器內(nèi)冷卻，稱量。酶解液中可溶性固形物(SS)含量按照下列公式計(jì)算：

式中：m1為5.0ml酶解液中的可溶性固形物含量，g；m2為樣品質(zhì)量，g；100/5為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 酶解方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將一定量的DDWF放入容器，加入水，攪拌均勻，加入酶，在設(shè)定溫度下酶解一定時(shí)間。酶解結(jié)束后，在95 ℃下滅酶15 min，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，定容，分析測(cè)定其水解度(DH)和可溶性固形物(SS)。

1.3.4 速溶核桃蛋白粉制備

DDWF在適宜條件下酶解，所得酶解液冷凍干燥，粉碎后，即為速溶核桃蛋白粉(Instant walnut flour，IWF)，裝袋，備用。

1.3.5 吸水性和吸油性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13]和[20]中的方法，略有改動(dòng)。稱取3 g蛋白樣品，放入離心管中，然后加入10倍量去離子水(或大豆色拉油)，攪拌均勻后，25 ℃下靜置30 min，離心(4 000 r/min，5 min)，倒出上清液，倒扣離心管在吸水紙上，以去掉離心管內(nèi)壁附著的水(或油)。然后，稱量，減去離心管質(zhì)量，則用蛋白吸水(或吸油)后質(zhì)量與蛋白樣品質(zhì)量之比表示其吸水性(或吸油性)，單位為g/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel分析整理，繪制圖表；采用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)處理見差異顯著性進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃餅粕及蛋白粉主要營(yíng)養(yǎng)組分

DWF、DDWF及IWF中主要組分如表1所示。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所購(gòu)脫脂核桃餅粕中含71.71%的蛋白質(zhì)，仍殘留14.11%的油脂。經(jīng)脫脂后，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至79.70%，殘留油脂0.95%，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從9.90%提高至13.78%。采用耐高溫α-淀粉酶處理后，DDWF中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至86.84%，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至2.27%。此外，脫脂、去淀粉處理，對(duì)于核桃蛋白粉的吸水性和吸油性，影響均不顯著(P≤0.05)，但是經(jīng)蛋白酶增溶改性后所得IWF的吸水性和吸油性顯著高于酶解前(P≤0.05)(表1)。

目前關(guān)于核桃仁中淀粉的相關(guān)信息，文獻(xiàn)報(bào)道很少，具體分子結(jié)構(gòu)及其功能特性還需深入研究。Savage G P 曾經(jīng)測(cè)定過(guò)15種不同產(chǎn)地核桃仁中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1.1%～2.8%)[2]。由此推測(cè)，當(dāng)脫去62.6%～70.3%的脂質(zhì)后，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%～10%范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與之接近。

表1 核桃餅粕及蛋白粉主要組分含量分析

注：表中除水分含量以外，其他組分均為干基含量；表中同一行數(shù)據(jù)上角標(biāo)注的相同字母表示無(wú)顯著差異，不同大寫字母表示差異極顯著(P≤0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。

幾種核桃蛋白粉中氨基酸組成分析如表2所示。結(jié)果顯示，核桃蛋白粉中含量最高的氨基酸為谷氨酸和精氨酸，鮮味氨基酸(Glu、Arg)和甜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Lys、Met)含量總和接近50%，所以核桃蛋白粉的口感鮮甜，苦味不明顯。酶法增溶改性使核桃蛋白含量略有降低，但是其必需氨基酸含量略有增加(表2)。

表2 不同核桃蛋白粉中的氨基酸組成/%

2.2 核桃蛋白單酶水解

2.2.1 木瓜蛋白酶

圖1是底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時(shí)間等因素對(duì)木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢(shì)。結(jié)果顯示，所有因素中，DH和SS都顯示出非常一致的變化趨勢(shì)。隨著底物濃度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趨勢(shì)(圖1a)；隨酶用量增加，DH和SS含量均呈幾乎線性增加(圖1b)；在30～70 ℃范圍內(nèi)，DH和SS含量在60 ℃時(shí)達(dá)到最高，70 ℃時(shí)因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖1c)；隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，DH和SS含量均呈增加趨勢(shì)，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖1d)。出于酶解效率、蛋白溶解度和成本等方面考慮，確定木瓜蛋白酶對(duì)核桃蛋白的適宜酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此條件下，核桃蛋白DH為3.09%，SS質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%。

圖1 木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 菠蘿蛋白酶

圖2是底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時(shí)間等因素對(duì)菠蘿蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢(shì)。結(jié)果顯示，隨著底物濃度增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趨勢(shì)(圖2a)；隨酶用量增加，DH和SS含量均呈幾乎線性增加(圖2b)；在30～70 ℃范圍內(nèi)，DH和SS含量在50 ℃時(shí)達(dá)到最高，此后因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖2c)；隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，DH和SS含量均呈增加趨勢(shì)，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖2d)。因此，綜合考慮后確定菠蘿蛋白酶適宜酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，酶用量1.0%，在50 ℃下水解4 h。在此條件下，核桃蛋白DH為2.20%，SS質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%。顯然，菠蘿蛋白酶對(duì)核桃蛋白的水解效果略遜于木瓜蛋白酶。這是因?yàn)椴ぬ}蛋白酶是一種高選擇性內(nèi)切酶，優(yōu)先水解堿性氨基酸(例如精氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基側(cè)上的肽鏈[18-19]。

圖2 菠蘿蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 風(fēng)味蛋白酶

底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時(shí)間等對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢(shì)如圖3所示。結(jié)果顯示，隨著底物濃度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低的趨勢(shì)(圖3a)；隨酶濃度增加，DH和SS含量均呈線性增加(圖3b)；在30～70 ℃范圍內(nèi)，DH和SS含量在50 ℃時(shí)達(dá)到最高，此后因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖3c)；隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，DH和SS含量均呈增加趨勢(shì)，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖3d)。因此，綜合考慮后確定風(fēng)味蛋白酶的適宜酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此條件下，核桃蛋白水解度為1.71%，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.33%。

圖3 風(fēng)味蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單酶水解的因素分析結(jié)果顯示，在適宜的條件下，木瓜蛋白酶的酶解效果最好，其次是菠蘿蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶水解效果最差。這與各種酶的酶解特性有關(guān)。風(fēng)味蛋白酶一般由米曲霉發(fā)酵制得，含有氨肽酶、羧肽酶，屬外切酶，通過(guò)末端水解多肽鍵，其水解產(chǎn)物多為游離氨基酸，一般用來(lái)改善酶解物風(fēng)味[19-20]。就以上單酶水解結(jié)果而言，可溶性固形物最高也只有30%，相應(yīng)水解度為2.20%。還不能達(dá)到核桃蛋白增溶改性目的。

2.3 核桃蛋白復(fù)合酶解

不同蛋白酶酶解位點(diǎn)不同，對(duì)蛋白質(zhì)的水解效果也不同。因此，復(fù)合酶解理論上可以獲得比單酶更高的酶解效果[11]。三種蛋白酶不同組合下的酶解結(jié)果見表3。復(fù)合酶解中，除了酶用量有調(diào)整外，其他酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h。結(jié)果顯示，就SS而言，在總酶用量1.0%條件下，組合1>組合9>組合5。這表明，在核桃蛋白酶是水解中，①木瓜蛋白酶起主導(dǎo)作用，減少其用量，會(huì)降低核桃蛋白水解效果。在木瓜蛋白酶用量增加的情況下，核桃蛋白的DH和SS都有明顯增加(見表3)，該結(jié)果與上述單酶水解結(jié)果一致(圖1、圖2和圖3)。此外，相同酶用量下，酶組合①+②與①+③相比，后者的核桃蛋白雖然具有較高的 DH，但是SS卻低于前者。該結(jié)果與③風(fēng)味蛋白酶的酶解特性有關(guān)：它是通過(guò)水解蛋白質(zhì)分子末端肽鍵，其產(chǎn)物為游離氨基酸，所以對(duì)DH的影響較大，但是對(duì)SS的影響不大。

表3 不同酶組合對(duì)核桃蛋白的水解結(jié)果

注：表中①木瓜蛋白酶，②菠蘿蛋白酶，③風(fēng)味蛋白酶。

表3中的組合13和組合12相比，增加了②菠蘿蛋白酶用量，核桃蛋白DH和SS不增反降(表3)，這似乎說(shuō)明在三酶復(fù)合酶解體系中，存在競(jìng)爭(zhēng)性水解：菠蘿蛋白酶用量的增加，抑制了木瓜蛋白酶的水解。是抑制了木瓜蛋白酶的活性，還是占據(jù)了木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)？具體抑制機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。從組合14-16可以看出，隨著③風(fēng)味蛋白酶用量增加，DH雖有明顯增加，但SS增幅不大。這也進(jìn)一步印證了③風(fēng)味蛋白酶外切酶的酶解特性。

綜合表3結(jié)果，SS值最高的組合12(①1.2%+②0.4%+③0.2%)，相應(yīng)的DH為5.57%，SS為48.33%；其次是組合4(①1.5%+②0.5%)，相應(yīng)的DH為5.36%，SS為47.50%。采用這兩種酶組合制備的速溶核桃粉(IWF)中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)83.26%，略低于DDWF中的86.84%，吸水性和吸油性得到顯著改善，分別提高了68.99%和52.48%(表1)；IWF中必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.77%，略高于DDWF中的11.11%(表2)，達(dá)到了DDWF增溶的目的。當(dāng)然，若繼續(xù)增加復(fù)合酶解中酶的用量，酶解效果會(huì)更好，但是考慮到成本，酶用量一般不宜超過(guò)3%。

2.4 酶解雙指標(biāo)的相關(guān)性分析

本研究中對(duì)于核桃蛋白水解效果的評(píng)價(jià)采用了水解度(DH，%)和可溶性固形物(SS，%)兩個(gè)指標(biāo)。其中，DH是在蛋白質(zhì)被催化水解時(shí)所裂解肽鍵數(shù)目的基礎(chǔ)上表示蛋白質(zhì)水解情況其測(cè)定方法有：OPA 法、TNBS法、TCA法、pH- Stat、甲醛固定法、茚三酮比色法等多種，且不同方法間差異較大[15-16]。文中采用的是茚三酮比色法，為更加準(zhǔn)確、便捷地評(píng)價(jià)核桃蛋白增溶效果，文中采用酶解液中可溶性固形物含量(SS，%)作為第二個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。與DH相比，SS測(cè)定方法更簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確。

圖4和表4結(jié)果表明，4種酶解條件下，DH和SS間均呈現(xiàn)顯著的線性正相關(guān)，相關(guān)性最高的是菠蘿蛋白酶(R2=0.879 9)，其次是復(fù)合酶(R2=0.843 9)和木瓜蛋白酶(R2=0.757 0)，風(fēng)味蛋白酶相關(guān)性最低(R2=0.638 5)。即便是相關(guān)性最低的風(fēng)味蛋白酶，其相關(guān)性也已達(dá)到極顯著水平(P=0.000 1)。因此，文中采用DH和SS雙指標(biāo)評(píng)價(jià)核桃蛋白酶法增溶效果是合適的。與DH測(cè)定相比，SS測(cè)定方法非常簡(jiǎn)便、快速，可直接反映核桃蛋白的溶解性。

圖4 不同蛋白酶水解過(guò)程中DH與SS間的相關(guān)性

表4 不同蛋白酶水解過(guò)程中DH與SS間的相關(guān)性

3 結(jié)論

以核桃蛋白水解度(DH)和酶解液中可溶性固形物(SS)含量為指標(biāo)，對(duì)木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等三種酶的單酶水解、復(fù)合酶解進(jìn)行分析比較，得到核桃蛋白增溶改性適宜的酶解條件是：木瓜蛋白酶1.2%+菠蘿蛋白酶0.4%+風(fēng)味蛋白酶0.2%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，50 ℃下酶解3 h。在此條件下所得速溶核桃粉DH為5.57%，SS為48.33%，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)83.26%，吸水性和吸油性得到顯著改善，分別提高了68.99%和52.48%，達(dá)到了DDWF酶法增溶改性目的。

DH和SS間相關(guān)性分析結(jié)果表明，DH和SS間存在極顯著相關(guān)性。說(shuō)明DH和SS雙指標(biāo)評(píng)價(jià)核桃蛋白酶法增溶效果比DH單指標(biāo)評(píng)價(jià)更加可靠，SS可與DH一起評(píng)價(jià)核桃蛋白的酶解效果或酶解程度。