中國傳統(tǒng)食醋微生物污染及控制措施研究進(jìn)展

王興潔，劉愛平，敖曉琳,2，吳遠(yuǎn)明，陳蓉，劉書亮,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014) 3(四川保寧醋有限公司，四川 閬中，637400)

食醋是以淀粉和(或)糖經(jīng)過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而制成的含醋酸的液態(tài)酸味調(diào)味品[1]。食醋按照工藝可分為以下兩類：以果實(shí)、糖類物質(zhì)、酒精為原料的液態(tài)發(fā)酵食醋，及以谷物為原料的固態(tài)發(fā)酵食醋[2]。歐美國家食醋普遍采用液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)釀制而成，其中最具代表的是英國麥芽醋(Malt vinegar)、意大利古典芳香醋(Balsamico)、西班牙雪利醋(Sherry winegar)及奧地利蘋果醋(Apple vinegar)[3]。中國及其他東南亞國家，主要采用多菌固態(tài)發(fā)酵工藝釀制食醋，其中中國四大名醋及日本米醋最受歡迎。固態(tài)發(fā)酵過程中除了醋酸菌之外，還有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌等微生物，它們在釀造過程中的共同作用賦予食醋豐富的滋味與氣味[4-5]。多菌種固態(tài)發(fā)酵的食醋由于多種微生物的混合代謝作用，能夠產(chǎn)生更豐富的有機(jī)酸、氨基酸和酯類物質(zhì)，使得食醋的口感更加飽滿柔和[6]。同時(shí)也使食醋具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌癥腫瘤、預(yù)防肥胖、降膽固醇、抗高血壓等多種功能性[7-9]。食醋作為我國傳統(tǒng)酸性調(diào)味品，擁有3 000多年的發(fā)展歷史，其生產(chǎn)離不開微生物的催化，隨著食醋發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，從自然菌群到單一菌株再到多菌種的使用，微生物在食醋發(fā)酵的過程中占據(jù)著越來越重要的地位。但微生物同時(shí)也是影響食醋品質(zhì)的極大威脅因素，有害微生物的污染和生長，不僅會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量還會(huì)對人們身體健康造成危害[10]。

本文綜述了中國食醋行業(yè)污染微生物的原因及危害，并對其檢測、控制措施進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為食醋污染微生物的深入研究提供參考。

1 食醋污染微生物的原因及危害

1.1 食醋污染微生物的原因

中國傳統(tǒng)食醋在生產(chǎn)過程中易受到微生物的污染。目前研究認(rèn)為微生物污染食醋主要原因有以下幾點(diǎn)：(1)傳統(tǒng)食醋的釀造過程為開放式，環(huán)境中的污染微生物極易進(jìn)入發(fā)酵體系，污染食醋[11]。(2)食醋生產(chǎn)過程中的容器與管道消毒滅菌不徹底，產(chǎn)品在儲(chǔ)存與運(yùn)輸以及包裝過程中管理不善，導(dǎo)致外來微生物污染。(3)食醋本身含有豐富的還原糖及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵過程中的某些芽孢桿菌會(huì)產(chǎn)生耐熱芽孢在后續(xù)殺菌中存活下來，在成品中生長繁殖，二次發(fā)酵導(dǎo)致產(chǎn)品污染[12]。

1.2 食醋污染微生物的危害

微生物污染食醋的危害是雙方面的，廠家及消費(fèi)者都受其害。首先，發(fā)酵過程中污染微生物進(jìn)入發(fā)酵體系，與發(fā)酵微生物產(chǎn)生競爭關(guān)系，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，發(fā)生糖化不徹底、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵弱等現(xiàn)象，降低出醋率[13]。其次，食醋成品出廠之前按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)異常，卻在貨架期內(nèi)發(fā)生變質(zhì)現(xiàn)象，這對企業(yè)產(chǎn)生直接的經(jīng)濟(jì)損失，并且使企業(yè)的形象在消費(fèi)者的心中一落千丈。最后，食醋在生產(chǎn)過程中會(huì)生成生物胺，少量的生物胺可提升食醋風(fēng)味品質(zhì)，但是過量生物胺則對人體有極大的危害。污染微生物在酸性環(huán)境下產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，分泌出氨基酸脫羧酶，氨基酸轉(zhuǎn)換為生物胺可使pH升高，有利于微生物在酸性環(huán)境中的生存[14-15]。微生物對食醋的污染導(dǎo)致食醋中生物胺等有害代謝物的含量增高，對消費(fèi)者的健康產(chǎn)生潛在危害。

中國食醋開放式的發(fā)酵工藝是食醋被微生物污染的根本原因，變質(zhì)食醋的危害可大可小，一旦控制不當(dāng)，在某個(gè)企業(yè)或者整個(gè)行業(yè)發(fā)生，將對食醋行業(yè)造成一定的影響和經(jīng)濟(jì)損失。

2 食醋中污染微生物種類及現(xiàn)象

微生物污染食醋后，成品出現(xiàn)的可觀察到的現(xiàn)象包括脹氣、產(chǎn)膜、發(fā)黏、沉淀增多返渾等，這些現(xiàn)象可單獨(dú)出現(xiàn)，也會(huì)并存出現(xiàn)。引起食醋變質(zhì)的微生物多種多樣，不可一概而論，在進(jìn)行食醋污染微生物的研究時(shí)，應(yīng)當(dāng)具有針對性地探索。作為人們生活不可或缺的傳統(tǒng)調(diào)味品，其污染微生物的研究還十分膚淺，有待深入。

2.1 食醋產(chǎn)氣污染菌

食醋脹氣問題由來已久，分為生物性脹氣和非生物性脹氣，其中微生物污染導(dǎo)致脹氣最為嚴(yán)重。馬凈麗等[16]認(rèn)為食醋脹氣變質(zhì)是令食醋(尤其是固態(tài)食醋)生產(chǎn)廠家非常頭疼的問題。在北方，每年3～4月份，食醋脹桶開始發(fā)生，并在6、7、8三個(gè)月呈泛濫之勢。雖然傳統(tǒng)食醋脹氣現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，但并未引起整個(gè)行業(yè)的注意。2015年6月某地的山西老陳醋發(fā)生明顯脹氣現(xiàn)象，無獨(dú)有偶，某曬醋公司的食醋也在同一年出現(xiàn)嚴(yán)重的脹氣現(xiàn)象[17-18]。眾多食醋企業(yè)相繼爆發(fā)出大規(guī)模的產(chǎn)品產(chǎn)氣現(xiàn)象，整個(gè)行業(yè)蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)關(guān)于食醋產(chǎn)氣污染菌的研究也逐漸深入。ENTANI等[19]1986年首次從日本變質(zhì)的谷物醋中分離鑒定出高耐酸乳酸菌，該菌生長緩慢，能引起谷物醋渾濁變質(zhì)。表1列舉了部分國內(nèi)外分離得到的食醋產(chǎn)氣污染微生物[20-22]。但馬凈麗等[16]未從脹氣食醋中分離得到產(chǎn)氣菌，劉芳[23]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與高通量測序相結(jié)合的方法對食醋產(chǎn)氣污染菌進(jìn)行研究，高通量測序結(jié)果表明，引起食醋脹氣變質(zhì)的微生物為乳桿菌屬，但通過固體培養(yǎng)基分離純化未能得到菌落，推測此產(chǎn)氣微生物存在活的不可培養(yǎng)狀態(tài)或不可培養(yǎng)導(dǎo)致難以分離的狀態(tài)。LI等[17]，白成松等[18]研究表明食醋脹氣菌難以分離，菌株受到食醋影響會(huì)發(fā)生特化，普通培養(yǎng)基可能無法分離，因此微生物分離方法需要改進(jìn)。

表1 食醋產(chǎn)氣污染菌Table 1 Microorganism that cause vinegar to produce gas

2.2 食醋產(chǎn)膜污染菌

食醋在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生一層菌膜，菌膜的存在對醋酸發(fā)酵是利是害還沒有一個(gè)確切的定論[24]。有觀點(diǎn)認(rèn)為，發(fā)酵過程中菌膜的形成不利于醋酸發(fā)酵，大量的研究報(bào)道表明，醋酸菌產(chǎn)生的菌膜組成成分主要為胞外多糖，形成這些物質(zhì)時(shí)菌體會(huì)消耗環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是碳源和氮源[25]，減少食醋的產(chǎn)量和降低發(fā)酵液的醋酸酸度，因此食醋釀造過程中應(yīng)嚴(yán)格控制菌膜的形成。對于成品醋而言，產(chǎn)膜則直接影響消費(fèi)者的選擇，給企業(yè)帶來不小的損失。趙爽等[26]從袋裝產(chǎn)膜醋中分離出8株產(chǎn)膜菌，對其中兩株進(jìn)行鑒定，一株為木葡糖醋酸桿菌(Gluconacetobacteroboediens)，另一株為巴氏醋桿菌(AcetobacterPasteurianus)。張永鳳[27]分離得到一株醋化醋桿菌木質(zhì)亞種(A.xylinum)Y22，所產(chǎn)菌膜主要成分是細(xì)菌纖維素。另外，產(chǎn)膜食醋中還分離出了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)[28]。

2.3 食醋發(fā)黏及返渾污染菌

食醋被微生物污染后出現(xiàn)發(fā)黏劣變，伴隨著醋液變黃，醋體流動(dòng)性變差，有拉絲現(xiàn)象，后期還會(huì)產(chǎn)生大量沉淀發(fā)生返渾現(xiàn)象。CAO等[29]對發(fā)黏食醋理化指標(biāo)和香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)食醋中總酸、乳酸、乙醇含量明顯上升，還原糖、總酯、糠醛含量明顯下降，并從中篩選出引起食醋發(fā)黏的主要微生物牛痘乳桿菌(Lactobacillusvaccinostercus)。王建云等[30]探討食醋發(fā)黏控制技術(shù)，篩選得到導(dǎo)致食醋發(fā)黏的微生物為芽孢桿菌(Bacillus)。楊新等[31]從變質(zhì)赤水曬醋中篩出增黏微生物4株，均為芽孢桿菌(Bacillus)。另有研究表明，鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)在醋液中會(huì)產(chǎn)生白色絮狀物，導(dǎo)致食醋黏稠[12]。

食醋的生物性返渾是食醋受到微生物污染后沉淀增多液體混濁的一類現(xiàn)象，其進(jìn)程較快，對感官、品質(zhì)有較大影響。目前報(bào)道的造成食醋返渾的微生物有芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，其中芽孢桿菌更容易使食醋發(fā)生返渾現(xiàn)象，而芽孢桿菌大量存在于食醋發(fā)酵過程中，后期殺菌過程不易殺滅，研究表明100 ℃處理30 min后，菌株仍能生長[28, 32-33]。

3 檢測方法

食醋污染微生物對中國傳統(tǒng)食醋行業(yè)的發(fā)展有著巨大的阻礙，但目前對食醋污染微生物的研究并不系統(tǒng)，在其檢測方面的研究也十分欠缺。在國內(nèi)，食醋出廠前需按照《GB 2719—2018 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食醋》進(jìn)行檢測，微生物指標(biāo)易受到pH值的影響[34]，且食醋中可能存在難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的污染微生物[35]，采用傳統(tǒng)檢測方法易發(fā)生錯(cuò)檢、漏檢的情況。

3.1 食醋污染微生物的可培養(yǎng)技術(shù)檢測方法

針對食醋污染微生物的檢測研究，大多數(shù)是通過人工制作的培養(yǎng)基直接進(jìn)行培養(yǎng)，這就要求培養(yǎng)基要為污染微生物提供所需的營養(yǎng)成分，得到培養(yǎng)物后再通過不同菌落、細(xì)胞形態(tài)，以及生理生化特征和分子鑒定來確定污染微生物的類型。雖然這是一種常見常用的檢測方法，但此類檢測方法有以下幾方面的不足：(1)檢測時(shí)間長。一般污染微生物檢測至少需要2 d，多則7 d以上[17]，檢測結(jié)果具有滯后性。(2)操作繁瑣，靈活性差。不同的污染微生物最適生長培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH等的確定需要花費(fèi)大量的人力物力[36]。(3)存在活的不可培養(yǎng)狀態(tài)微生物或不可培養(yǎng)微生物。此類微生物難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，不能通過傳統(tǒng)檢測方法檢測出來[37]。

3.2 食醋污染微生物的非培養(yǎng)技術(shù)檢測方法

微生物非培養(yǎng)技術(shù)是指應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對微生物進(jìn)行檢測鑒定。自1986年P(guān)ACE等[38]首次將5S rRNA基因用于環(huán)境樣品中總微生物的測定，隨之很快被應(yīng)用于微生物多樣性研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)在檢測方面極大地提高了檢測效率，具有方便、快捷、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)[39]。

啤酒作為與食醋類似的一類發(fā)酵食品，對其污染微生物的快速檢測技術(shù)研究較多。目前對啤酒有害微生物的PCR檢測技術(shù)有普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、PCR-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)3種方法[40]。使用特異性引物的PCR技術(shù)可快速檢測和鑒定啤酒中的腐敗微生物，檢測結(jié)果既靈敏準(zhǔn)確又快速方便。而利用微生物非培養(yǎng)技術(shù)檢測食醋污染微生物的研究較少，現(xiàn)有研究多集中在食醋發(fā)酵過程中微生物群落變化[41]。ZHAI等[20]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技術(shù)對污染醋樣的微生物結(jié)構(gòu)和種類進(jìn)行分析，并與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法結(jié)合，結(jié)果方便可靠。欒春光等[42]利用高通量測序技術(shù)鑒定陳醋脹壺微生物菌群，結(jié)果表明，在食醋樣本中普遍存在某些已經(jīng)適應(yīng)了釀造食醋微環(huán)境的未培養(yǎng)微生物。

除純培養(yǎng)法和PCR技術(shù)外，還有電阻抗法、微量量熱法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)、酶聯(lián)免疫法、ATP生物發(fā)光檢測技術(shù)等快速檢測方法[43-44]。目前傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)不能滿足食醋行業(yè)的日益發(fā)展，而各類新的檢測方法還在起步階段，未能應(yīng)用于實(shí)際之中。隨著研究的不斷深入，建立食醋污染微生物的快速檢測方法，尤其是針對成品食醋中難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的有害微生物檢測方法，并應(yīng)用于食醋行業(yè)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4 控制措施

4.1 防腐劑對食醋污染菌的控制

中國傳統(tǒng)食醋因其高酸度不易變質(zhì)的特點(diǎn)，食品防腐劑的使用并沒有受到重視，特別是各大名醋的特級產(chǎn)品，均是以不添加防腐劑為噱頭。引起食醋變質(zhì)的微生物不同，防腐劑對其控制效果好壞也不等。趙爽等[26]的研究表明，3種防腐劑(尼泊金乙酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀)均對食醋產(chǎn)膜污染菌有抑制作用，可通過添加防腐劑來控制貨架期內(nèi)食醋產(chǎn)膜。李偉麗等[45]從腐敗醋中篩選出84株不同微生物，以芽孢桿菌為主，苯甲酸鈉對芽孢桿菌的最小抑菌濃度已經(jīng)超出其在食品中允許的最大添加量，使用新型防腐劑Nisin，在安全范圍內(nèi)可抑制芽孢桿菌的增殖生長。楊榮杰等[46]探究了4種防腐劑對食醋中產(chǎn)膜芽孢桿菌的抑制效果，其中Nisin和ε-聚賴氨酸兩種天然防腐劑抑菌效果最好，因此研究低成本高效的天然防腐劑刻不容緩。王玉美等[32]添加1 g/kg苯甲酸鈉于含有105CFU/mL芽孢桿菌的醋液中，可以延長返渾時(shí)間7 d。雖然防腐劑可以抑制產(chǎn)膜及返渾污染微生物，但防腐劑對食醋脹氣污染菌的抑制效果不佳，馬凈麗等[16]研究了新型防腐劑(尼泊金乙酯、Nisin)對脹氣食醋的防腐作用，結(jié)果表明添加尼泊金乙酯、Nisin 可推遲脹瓶發(fā)生，但在貨架期內(nèi)還是會(huì)發(fā)生脹氣變質(zhì)。

4.2 加熱對食醋污染菌的控制

中國傳統(tǒng)食醋生產(chǎn)過程都要經(jīng)過熬煮工序，在這個(gè)過程中一些不耐熱污染微生物可以被殺滅[47]。但食醋在后期運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中仍存在被外界微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致最終產(chǎn)品變質(zhì)，包裝前的加熱處理十分必要。ZHAI等[20]對1株食醋污染菌進(jìn)行加熱處理，93 ℃處理30 s后菌株的存活率為0.67%，處理60 s后幾乎沒有活菌存在。馬凈麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致食醋脹氣的微生物是一種非常耐熱的桿菌，將脹氣食醋在90～100 ℃煮40 min，微生物仍能存活，提高滅菌溫度則會(huì)影響食醋風(fēng)味。超高溫瞬時(shí)滅菌作為一類新興技術(shù)，有望解決此類問題。王建云等[30]應(yīng)用超高溫瞬時(shí)滅菌技術(shù)對食醋進(jìn)行滅菌處理，優(yōu)化滅菌條件得出145 ℃，6 s處理可較好解決由微生物污染而引起的食醋發(fā)黏變質(zhì)，且不影響食醋風(fēng)味。

除上述控制措施外，對于食醋污染菌的控制還可采用紫外線消毒技術(shù)、膜過濾技術(shù)等處理后可一定程度減少菌量[48-49]。以上控制措施雖然可以抑制或減少食醋污染微生物的數(shù)量，但是治標(biāo)不治本，控制食醋因微生物污染而發(fā)生變質(zhì)的最關(guān)鍵措施是減少外來污染。中國傳統(tǒng)食醋開放式發(fā)酵過程極易受到環(huán)境中微生物的污染，作為傳統(tǒng)行業(yè)應(yīng)在保持原有風(fēng)味的同時(shí)，不斷向潔凈的現(xiàn)代化工廠設(shè)計(jì)靠近，保證生醋熬制、熟醋的運(yùn)輸儲(chǔ)存、管罐路的清潔衛(wèi)生、包材的消毒、包裝車間凈化符合要求，才能從根本上控制污染微生物引起的食醋變質(zhì)。

5 結(jié)語

中國傳統(tǒng)食醋在我國人們?nèi)粘Ｉ钪姓剂耸种匾牡匚唬a(chǎn)量在世界范圍內(nèi)逐年增長，但目前對食醋的研究多集中在食醋風(fēng)味物質(zhì)以及發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)的變化等方面，對于食醋污染微生物的研究少見系統(tǒng)報(bào)道。綜上所述，傳統(tǒng)食醋極易受到發(fā)酵過程和環(huán)境微生物污染而發(fā)生變質(zhì)，對企業(yè)及消費(fèi)者產(chǎn)生影響。污染微生物種類繁多，情況不盡相同，現(xiàn)有的檢測技術(shù)及控制措施存在一定的缺陷。傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)耗力且可能對新型脹氣菌無效，新型檢測方法應(yīng)當(dāng)圍繞特異性、靈敏性、快速性展開研究。目前的控制措施各有利弊，在不破壞食醋風(fēng)味的前提下，更加有效、安全的殺菌抑菌技術(shù)需要不斷探索。另外，構(gòu)建腐敗變質(zhì)食醋中難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物的基因組庫以及食醋變質(zhì)過程中微生物群落多態(tài)性，將會(huì)對防止食醋變質(zhì)提供有價(jià)值的理論依據(jù)。