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    國產(chǎn)醬油二次沉淀研究進展和展望

    2019-06-06 06:52:14楊明泉高獻禮劉占余雪婷胡鋒張軍柯陳穗
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年10期
    關鍵詞:醬油氨基酸蛋白質

    楊明泉,高獻禮,劉占,余雪婷,胡鋒,張軍柯,陳穗*

    1(廣東美味鮮調味食品有限公司,廣東 中山,528401) 2(江蘇大學,江蘇 鎮(zhèn)江,212013)

    醬油起源于中國,距今已有超過2 500年的歷史,在我國日常生活和食品工業(yè)中均扮演著極為重要的作用[1]。隨著我國食品工業(yè)整體技術水平、管理水平和消費水平的提高,國產(chǎn)醬油的產(chǎn)量和產(chǎn)值均快速增加,2016年分別達到了1 000萬t和630億元以上。目前國產(chǎn)醬油和日本韓國醬油相比,產(chǎn)品理化指標基本相當,但在國內市場上單位重量國產(chǎn)醬油的價格顯著低于日本醬油[2]。國產(chǎn)醬油的二次沉淀問題是導致這種巨大價格差異的關鍵原因之一(見表1)[3-4]。

    表1 國產(chǎn)醬油和日本醬油價格差異Table 1 The big price differences between Chinese-type soy sauce and Japanese-type soy sauce

    注:日本一線品牌醬油的價格是國產(chǎn)一線品牌醬油價格的12.22倍(2018年6月,江蘇省鎮(zhèn)江市華潤萬家超市)。

    醬油二次沉淀是指醬油包裝之后在儲存、運輸和銷售過程中在瓶底形成的土黃色至紅棕色狀沉淀(如圖1所示),醬油二次沉淀是相對于其原油在儲存和加熱殺菌過程中形成的一次沉淀而言的[5]。

    圖1 國內外市場上醬油二次沉淀現(xiàn)象Fig.1 The secondary precipitate of soy sauce at home and abroad markets注:上述C和D照片拍攝時間2017年3月,地址美國紐約州。國產(chǎn)醬油(A、B、C)瓶底布滿一層黃色泥土狀沉淀,而日本醬油(D)瓶底無可見沉淀。

    高獻禮等[6]通過對市售25種醬油分析得出國產(chǎn)醬油二次沉淀含量比日本醬油二次沉淀含量高64%~94%,外觀質量明顯低于日本醬油。隨著國內消費者生活水平的提高、日本高檔醬油大量進入中國市場和國產(chǎn)醬油“走出”國門,部分國內消費者和國外消費者已難以接受有二次沉淀現(xiàn)象的醬油。原因如下:(1)搖動和振蕩情況下醬油二次沉淀容易引起醬油渾濁,嚴重影響醬油外觀質量,甚至會讓部分國內消費者和國外消費者誤認為醬油已經(jīng)腐敗變質。(2)日本醬油已成功解決二次沉淀問題,是國內外市場上公認的高檔產(chǎn)品;而國產(chǎn)醬油二次沉淀問題較為普遍,這種外觀質量的顯著差異嚴重影響消費者的購買選擇。

    由于日本醬油在生產(chǎn)原料、原料處理工藝、發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝和醬油原油后處理工藝上與國產(chǎn)醬油存在較大差異及其二次沉淀處理技術保密的原因,國產(chǎn)醬油要徹底解決二次沉淀問題必須根據(jù)國產(chǎn)醬油自身原料、菌種和工藝特點進行深入研究。目前國內企業(yè)和研究人員在解決醬油二次沉淀問題方面已經(jīng)取得了一定的進展,但距離徹底解決國產(chǎn)醬油二次沉淀問題仍有較長的路要走[4,7-10]。現(xiàn)就國產(chǎn)醬油二次沉淀研究進展和未來研究方向綜述如下,以期對醬油企業(yè)和研究人員提供一定參考。

    1 國產(chǎn)醬油二次沉淀組成、形成機制及去除技術研究進展

    隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活品質的提高,消費者已不滿足于醬油僅僅提供基本的調味功能,對醬油的內在(如安全性)和外在品質(如色澤、體態(tài))要求也越來越高。中國加入WTO后,大量高品質日本醬油進入國內市場并占據(jù)了國內醬油的高端市場,使國內醬油企業(yè)和研究人員認識到提高國產(chǎn)醬油品質的重要性和迫切性。其中,國產(chǎn)醬油嚴重的二次沉淀問題是國產(chǎn)醬油和日本醬油最直觀的差距,因此國產(chǎn)醬油的二次沉淀問題受到了企業(yè)和研究人員的重視。目前國內對醬油二次沉淀的研究主要集中在如下三個方面:醬油二次沉淀的組成、形成機制和去除方法。

    1.1 醬油二次沉淀的組成

    國產(chǎn)醬油二次沉淀主要成分如表2所示。

    表2 不同研究者測得的醬油中二次沉淀的組成 單位:g/100 mL

    由表2可知,國產(chǎn)醬油二次沉淀主要由蛋白質、總糖、NaCl和灰分等組成,文獻顯示蛋白質也是日本醬油二次沉淀的主要成分[11]。不同研究者所測定的蛋白質、總糖、灰分和NaCl含量差異較大,這可能與所測定的樣品生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝和二次沉淀取樣及干燥程度不同有關。令人意外的是醬油二次沉淀中存在少量的氨基酸、脂肪和大量的NaCl,這說明國產(chǎn)醬油二次沉淀的形成機制較復雜,僅僅降解醬油發(fā)酵液中的大分子物質(蛋白質和多糖)可能難以徹底解決醬油二次沉淀現(xiàn)象。

    蛋白質是國產(chǎn)醬油二次沉淀中含量最豐富的有機物質,被認為是引起醬油二次沉淀現(xiàn)象的關鍵物質[3,11]。GAO等[3]通過SDS-PAGE電泳結合MALDI-TOF-MS技術對國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白質進行了分離和鑒定,證明大豆11 S球蛋白G4蛋白中的堿性B3多肽和G1蛋白中的酸性A1a多肽分別占二次沉淀蛋白的75.8%和19.4%(見圖2),據(jù)可查資料顯示這是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白被首次分離和鑒定,為徹底解決國產(chǎn)醬油二次沉淀奠定了基礎和指明了研究方向。

    圖2 國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白和上清蛋白電泳圖Fig.2 The electrophorogram of secondary precipitate proteins of Chinese-type soy sauce注:泳道1和2為二次沉淀電泳圖;泳道3和4為上清電泳圖。

    此外,國內研究者對醬油二次沉淀蛋白的氨基酸組成也進行了分析。由表3可知,不同研究者所測得的國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白質中的氨基酸含量和組成均存在較大差異。按照質量含量計算,張志航等[15]測定的結果顯示谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸/賴氨酸是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白中含量最高的氨基酸;曾新安等[5]測定的結果顯示谷氨酸、絲氨酸和亮氨酸是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白中含量最高的氨基酸;高獻禮等[14]測定結果顯示谷氨酸、天門冬氨酸和亮氨酸是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白中含量最高的氨基酸;而孫鵬飛等[16]測定結果顯示谷氨酸、天門冬氨酸和絲氨酸是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白中含量最高的氨基酸。而按照摩爾百分含量計算,高獻禮等[14]和孫鵬飛等[16]測定的結果較為接近,但與張志航等[15]和曾新安等[5]測定的結果存在一定差異,特別是含量最高的3種氨基酸種類和含量差異較大。相同的是無論按照質量含量計算和還是摩爾百分比計算,谷氨酸均是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白中含量最高的氨基酸,這與谷氨酸在大豆蛋白中含量最高有關[17]。二次沉淀的收集方式及二次沉淀的干燥方式和程度會對醬油二次沉淀中蛋白質的含量造成影響,進而對其氨基酸含量造成影響[14]。

    表3 國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白氨基酸組成 單位:%

    1.2 國產(chǎn)醬油二次沉淀形成機制

    由于技術保密和語言的問題,國內對日本在醬油二次沉淀形成機制方面的研究了解極為有限??刹橘Y料顯示,日本20世紀70~90年代對醬油一次沉淀的形成機制進行了一系列的研究[11,18-20],研究結果認為醬油原油在加熱過程中在60 ℃時會形成促沉因子L-谷氨酸-5-丁酯,在85 ℃時會形成沉淀抑制因子,促沉因子在促進醬油原油中蛋白質的絮凝沉淀中扮演著重要作用。此外,日本學者研究認為醬油沉淀的形成不遵守“蛋白質熱變性曲線”,這種現(xiàn)象是原油中耐熱中性蛋白酶不失活和堿性蛋白酶的疏水性引起的[18,21]。為了防止醬油包裝后和銷售過程中形成二次沉淀,進而影響產(chǎn)品外觀品質。TOMITA等[11,20]分離、鑒定和合成了醬油促沉因子L-谷氨酸-5-丁酯及其一系列結構類似物,嘗試將其作為一種添加劑應用于醬油生產(chǎn)過程中(加速醬油沉淀形成),減少醬油二次沉淀的形成。結果顯示L-谷氨酸-5-丁酯是最優(yōu)的醬油促沉因子,有作為醬油促沉劑和改善醬油外觀品質的潛力。

    國內對醬油二次沉淀形成機制的研究相對于日本較晚,而且較少。由于國內外學者均認為醬油二次沉淀的主要和關鍵物質是大豆蛋白,因此,國內學者主要嘗試從醬油二次沉淀蛋白質本身的理化性質方面闡明二次沉淀形成的機制。如張志航等[15]對國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白質的氨基酸組成進行了分析。研究結果認為二次沉淀蛋白中疏水性氨基酸含量高導致其疏水性強,此外,二次沉淀蛋白中的氨基酸側鏈在某些酶的催化下發(fā)生了化學反應,導致其在高鹽環(huán)境下溶解性下降。上述兩個原因是導致國產(chǎn)醬油二次沉淀形成的原因。GAO等[3]對國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白進行了分離、鑒定和理化性質分析。研究結果認為大豆11S球蛋白G4蛋白中的堿性B3多肽和G1蛋白中的酸性A1a多肽是國產(chǎn)醬油二次沉淀蛋白的主要成分,兩種多肽較高的疏水性氨基酸含量及較低的β-折疊和無規(guī)卷曲比例是導致兩種多肽在高鹽環(huán)境下沉淀的原因。前期文獻報道顯示醬油渣中殘留的蛋白質含量高達20%~30%[22-24],均為在高鹽環(huán)境下難于被蛋白酶降解的蛋白質。高獻禮等[25]對醬油渣蛋白質進行了分離鑒定,結果顯示大豆11S球蛋白G4蛋白中的堿性B3多肽含量占醬油渣總蛋白含量59%以上,而大豆11S球蛋白G4蛋白中的堿性B3多肽的溶解性低也可能是導致其難于被降解并沉淀的關鍵原因[26]。而陳杰等[27]研究認為老抽醬油在放置過程中不斷產(chǎn)生沉淀的主要原因是糖蜜原料中的部分雜質在炒制焦糖色的過程中形成了不耐高鹽的物質,該物質在老抽醬油的貯存過程中聚集沉淀。也有部分國內學者認為醬油二次沉淀產(chǎn)生的原因與發(fā)酵菌種、原料蒸煮、制曲工藝、發(fā)酵工藝和熱殺菌工藝等有密切關系[28]。此外,高獻禮等[6]通過統(tǒng)計學的方法研究認為醬油二次沉淀的形成與醬油中總糖、總氮和無鹽固形物的含量呈顯著正相關,與醬油pH、還原糖、NaCl、氨基酸態(tài)氮含量無統(tǒng)計學意義上的相關性。此外,分析結果顯示醬油的發(fā)酵方式、主要原料、質量等級和產(chǎn)地對醬油二次沉淀的形成存在較大影響,而醬油類型對醬油二次沉淀的形成不存在明顯影響。

    從以上分析可知,日本對醬油二次沉淀形成機制研究較早,而且比較深入,這為日本醬油二次沉淀的解決提供了理論支撐。而國內對醬油二次沉淀形成機制較晚,尚不夠深入。

    1.3 醬油二次沉淀去除技術

    由于技術和專利保密的原因,國內對發(fā)達國家(主要指日本)醬油二次沉淀去除技術知之甚少[29]。推測認為日本企業(yè)主要通過長期的反復低溫(0 ℃)和常溫靜置法去除醬油二次沉淀。此外,由于中日醬油在發(fā)酵菌種(日本:醬油曲霉/中國:米曲霉3.042)、原料(日本:豆粕和小麥/中國:大豆和面粉)、原料處理(日本:超高溫短時/中國:高溫長時)、發(fā)酵工藝(日本:低溫控溫發(fā)酵/中國:常溫日曬夜露)和后處理工藝(日本:低溫或常溫長時間反復靜置沉淀/中國:常溫靜置或硅藻土過濾)等方面存在較大差異[30-34]。因此,國內企業(yè)和研究人員應根據(jù)國產(chǎn)醬油生產(chǎn)原料、發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、生產(chǎn)設備和原油理化特性等具體情況開發(fā)出適用于國產(chǎn)醬油二次沉淀的去除技術。目前國內企業(yè)主要采用硅藻土過濾法去除醬油二次沉淀,其優(yōu)勢是綜合處理成本低(60~80元/t), 但在處理后(10 d以后)又會逐漸在瓶底形成沉淀,效果較差[35]。部分高檔醬油采用錯流膜過濾法去除醬油二次沉淀,其優(yōu)勢是相對于硅藻土過濾法效果較好,但該方法處理綜合成本高(120~150元/t)、膜再生困難且耗時。國內研究人員也嘗試采用其他方法減少國產(chǎn)醬油的二次沉淀。如通過添加蛋白酶制劑降解醬油原油中“潛在的二次沉淀蛋白”達到減少醬油二次沉淀的目的[7],或通過添加澄清劑共絮凝法[8-10]或通過膜過濾法[36]或改變原料蒸煮工藝法去除醬油二次沉淀[37]。此外,王聰?shù)萚38]將國產(chǎn)醬油沉淀分為原沉淀(原油在未經(jīng)任何處理時發(fā)生的沉淀)、一次沉淀(原有殺菌后、包裝前產(chǎn)生的沉淀)和二次沉淀(包裝后產(chǎn)生的沉淀),原沉淀主要是未完全分解的大豆細胞和菌體引起的,通過優(yōu)化原油自沉淀溫度和時間不但能夠減少原沉淀,而且能夠減少醬油二次沉淀和改善醬油風味。上述報道方法雖然在一定程度上改善了國產(chǎn)醬油二次沉淀問題,但商業(yè)化推廣應用尚未見報道。

    適當?shù)某曁幚砟軌蝻@著提高某些蛋白質的水溶性和疏水性、促使肽鏈伸展和改變其轉變溫度,因此,超聲處理可能提高醬油發(fā)酵過程中蛋白酶的活性和/或促使二次沉淀蛋白質向著有利于酶解反應的方向發(fā)展或者加速其沉淀[39-40]。此外,不同的超聲頻率、功率、時間和模式(單頻、雙頻和多頻超聲)處理能夠引起蛋白質結構的不同改變[41-44],對于醬油中存在的蛋白酶和二次沉淀蛋白這類結構復雜的蛋白質也是如此。因此,超聲技術在醬油二次沉淀去除方面具有潛在的應用價值。

    2 展望

    由以上分析可知二次沉淀問題已經(jīng)成為困擾我國醬油行業(yè)的重大問題,嚴重影響國產(chǎn)醬油外觀質量和國內外市場上的競爭力。目前國內尚未掌握高效、安全和經(jīng)濟的醬油二次沉淀去除技術,這與我國對醬油二次沉淀形成機制研究不深入密切相關。綜上所述,要徹底解決國產(chǎn)醬油的二次沉淀問題應在如下方面進行深入研究:(1)對國產(chǎn)醬油二次沉淀成分進行全面和深入的分析,篩選出其中促進絮凝共沉淀的關鍵催化因子,并闡明在高鹽環(huán)境下二次沉淀成分之間形成共沉淀的反應途徑和機制,進而開發(fā)出高效、安全和經(jīng)濟的去除導致醬油二次沉淀形成的關鍵催化因子技術。(2)通過超聲法或者超聲結合微生物發(fā)酵法(或酶法)高效、安全和經(jīng)濟地在醬醪發(fā)酵階段(高鹽稀態(tài)醬油)或原油儲存過程中(低鹽固態(tài)醬油)去除或者降解醬油二次沉淀成分(主要為大豆蛋白B3和A1a多肽),將醬油二次沉淀成分充分再利用,并達到去除國產(chǎn)醬油二次沉淀和改善醬油外觀質量的目的。

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