橄欖油中甘油二酯異構(gòu)體測定方法研究與應(yīng)用初探

魏瑤，鐘其頂*，王道兵,3，李國輝

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京，100015) 3(山東金勝糧油集團(tuán)有限公司，山東 臨沂，276000)

甘油二酯(diacylglycerols, DAGs)是甘油三酯(triacylglycerols, TAGs)中1個(gè)脂肪酸酯基水解生成了羥基的脂質(zhì)物質(zhì)，包含1個(gè)甘油骨架和2個(gè)脂肪酸殘基。DAGs是天然植物油脂的微量成分及體內(nèi)脂肪代謝的內(nèi)源中間產(chǎn)物，在食品行業(yè)、化工行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域均具有很多應(yīng)用[1-4]。DAGs有2種同分異構(gòu)體，分為1,2-DAGs與1,3-DAGs，這2種異構(gòu)體是由于脂肪酸在甘油主干鏈上的連接位置不同而形成的[5]，其中1,2-DAGs是植物油中天然的中間體，是TAGs合成或降解過程中的中間產(chǎn)物，而1,3-DAGs是由1,2-DAGs經(jīng)酶反應(yīng)或化學(xué)異構(gòu)化得到，有研究表明，溫度、PH和?；w移酶的存在等都會影響1,2-DAGs向1,3-DAGs的轉(zhuǎn)化[6-7]，當(dāng)二者達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，1,3-DAGs與1,2-DAGs的比例在6∶4～7∶3，由于分子的空間效應(yīng)，1,3-DAGs在熱力學(xué)上更加穩(wěn)定[8]。經(jīng)過了精煉和長期存儲的植物油中1,3-DAGs的含量會有明顯的增長趨勢，1,3-DAGs含量的增加或者1,3-DAGs/1,2-DAGs值的增加與植物油感官質(zhì)量的降低有關(guān)[9]。因此DAGs異構(gòu)體的含量比例特征可用于植物油的質(zhì)量鑒別[10]。

當(dāng)前對DAGs的檢測方法主要有薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)結(jié)合MALDI-TOF[11-12]或ESI-MS法[13-15]，其中，TLC法成本低且操作簡易，但缺點(diǎn)是精度不高，重復(fù)性差[16]；HPLC法雖然簡便快捷，但檢出限受限，故常用于分析人工制備得到的甘油二酯含量，而對植物油樣品中本身微量甘油二酯檢測效果不佳[17]。然而該2種方法均只能檢測出油脂中甘油二酯總量，且檢出限通常高于1 mg/mL。 氣相色譜法是常用的快速測定油脂中DAGs的方法，ISO 29822:2009規(guī)定了測定油脂中甘油二酯異構(gòu)體的GC-FID方法[18]，而ZHU等認(rèn)為由于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的短缺難以直接引用ISO方法，故而應(yīng)用EI-MS和EI-MS/MS方法定性分析了橄欖油中DAGs異構(gòu)體的特征[6]，PEREZ等在此基礎(chǔ)上研究了橄欖油存儲溫度和時(shí)間對DAGs異構(gòu)體的影響[19]。然而，我國對DAGs的分析與應(yīng)用主要集中在制備方法和功能研究領(lǐng)域，對微量DAGs異構(gòu)體的研究報(bào)道較少[20-24]。

本研究在ZHU等和ISO方法定性分析的基礎(chǔ)上，引入定量分析的研究[25-27]。借助GC-MS對DAGs異構(gòu)體進(jìn)行定性分析，通過GC-FID方法進(jìn)行定量測定，降低了對分析儀器的要求，以利于為實(shí)際應(yīng)用中大批量的樣品檢測節(jié)約成本。優(yōu)化了衍生條件，最后研究了初榨橄欖油和精煉橄欖油中DAGs異構(gòu)體含量特征的異同，以及實(shí)現(xiàn)了1,3-油酸二酯的精確定量，旨在為我國橄欖油市場監(jiān)管及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持，這對促進(jìn)我國橄欖油標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，保護(hù)我國食用油市場有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種新鮮初榨橄欖油和4種精煉橄欖油，來自意大利的真實(shí)樣品；氮?dú)?純度為99.99%)，北京北溫氣體制造廠；丙酮、甲苯和異辛烷(色譜純)，DUKSAN Pure Chemicals公司；異丙醚(分析純)，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；乙醚(分析純)，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺(MSHFBA)，F(xiàn)luorochem公司；1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混合標(biāo)品、1,3-油酸二酯標(biāo)品、1-甲基咪唑、1 000 mg/6 mL二氧化硅SPE小柱，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent6890氣相色譜儀、FID檢測器，安捷倫科技(中國)有限公司；GC-MS-QP2020氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；DB-5ht氣相色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.1 μm)，安捷倫科技(中國)有限公司；電熱恒溫加熱箱，北京福意聯(lián)電器有限公司；MTN-2800D氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；十萬分之一電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)品衍生

稱取約0.01 g的1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混標(biāo)以及1,3-油酸二酯單標(biāo)，精確至0.1 mg，用甲苯配成10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取50 μL氮吹至干后，加入100 μL甲基硅烷化衍生劑V(1-甲基咪唑)∶V(MSHFBA)=1∶20，使衍生質(zhì)量濃度為5 mg/mL(保證衍生劑過量)，充分搖勻后密封，置于30 ℃恒溫箱中靜置衍生，衍生結(jié)束后加入900 μL丙酮，分別用GC-MS和GC-FID測定。

1.3.2 樣品處理

SPE過程：二氧化硅SPE小柱先用4 mL甲苯活化。取橄欖油樣品0.1 g溶于1 mL甲苯中，渦旋1 min， 移至SPE二氧化硅硅膠柱中。用2 mL甲苯淋洗后，加3.5 mL異辛烷/異丙醚混合液(體積比為85∶15) 洗脫含有TAGs的疏水化合物，重復(fù)1次后，加3.5 mL乙醚洗脫含有DAGs的極性成分，重復(fù)1次，收集含DAGs的洗脫液氮吹至干。

樣品衍生：氮吹至干后稱重，以5 mg/mL的衍生質(zhì)量濃度加入甲基硅烷化衍生劑V(1-甲基咪唑)∶V(MSHFBA)=1∶20，進(jìn)行衍生反應(yīng)，充分搖勻后密封，置于30 ℃恒溫箱中靜置衍生，衍生結(jié)束后加入900 μL丙酮，分別用GC-MS和GC-FID儀測定。

1.3.3 GC方法

GC-FID與GC-MS氣相色譜條件：DB-5ht氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.1 μm)；升溫程序：初溫180 ℃ 保持2 min，以15 ℃每分鐘增加到330 ℃，保持15 min；載氣(N2)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1；進(jìn)樣口溫度260 ℃。

GC-MS質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV； 傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度200 ℃；燈絲電流80 μA；質(zhì)量掃描范圍m/z200～650；掃描間隔時(shí)間1 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖油中甘油二酯特征峰的確定

由于構(gòu)成甘油二酯的脂肪酸可以多種多樣，而可以購買到的DAGs異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品只有4種，不足以對橄欖油中DAGs特征峰定性，因此用GC-MS進(jìn)行定性分析。對1,2-與1,3-棕櫚酸二酯混標(biāo)以及1,3-油酸二酯單標(biāo)的衍生物用GC-MS測定，得到其主要質(zhì)譜特征峰的EI-MS圖(圖1)，其中[M-15]+離子(M-表示對應(yīng)甘油二酯衍生物特定基團(tuán)上的分子質(zhì)量或分子式)在棕櫚酸二酯的626m/z出現(xiàn)，在1,3-油酸二酯離子質(zhì)譜檢測范圍(200～650m/z)未出現(xiàn)，因此[M-15]+離子可作為定性棕櫚酸二酯的特征離子。[M-RCO2CH2]+只在1,3-DAGs中出現(xiàn)，可作為1,3-DAGs的特征離子，用于區(qū)分甘油二酯異構(gòu)體的構(gòu)型。[RCO]+與[M-90-153]+僅在1,3-油酸二酯中出現(xiàn)，可作為判別1,3-油酸二酯的部分特征離子。另外，[M-RCO2]+在1,3-油酸二酯的411m/z出現(xiàn)，且強(qiáng)度最高。[RCO2+58]+在1,2-DAGs結(jié)構(gòu)中強(qiáng)度明顯高于1,3-DAGs結(jié)構(gòu)。綜上，可以通過[M-RCO2CH2]+離子區(qū)分1,2-DAGs與1,3-DAGs；通過[M-15]+、[M-89]+、[M-RCO2]+、[RCO2+58]+、[RCO]+與[M-90-153]+離子判斷DAGs種類。

通過對橄欖油樣品分析，對照表1和圖2中各種甘油二酯異構(gòu)體標(biāo)品的特征離子種類和對應(yīng)的相對豐度，確定了橄欖油中幾種主要的特征DAGs異構(gòu)體的種類以及在GC-MS和GC-FID色譜圖中的出峰順序，確定了1,2-油酸棕櫚酸二酯、1,3-油酸棕櫚酸二酯、1,2-油酸二酯和1,3-油酸二酯的保留時(shí)間分別為13.9、14.2、15.18、15.51 min，這與ZHU等的研究結(jié)果相符[6]。

A- 1,2-棕櫚酸二酯衍生物；B-1,3-棕櫚酸二酯衍生物；C-1,3-油酸二酯衍生物圖1 棕櫚酸二酯和油酸二酯異構(gòu)體甲基硅烷衍生物的EI-MS圖Fig.1 EI-MS spectra of dipalmitin and diolein isomers

表1 不同的甘油二酯標(biāo)品衍生物特征碎片離子和相對豐度Table 1 Characteristic EI-MS fragment ions and the relative abundances observed in various DAG standards

離子種類1,2-棕櫚酸二酯1,3-棕櫚酸二酯1,3-油酸二酯[M-15]+626(54)626(22)N/D[M-89]+551(8)550(8)602(18)[M-RCO2]+385(65)385(18)411(100)[RCO2+58]+313(100)313(18)339(36)[M-RCO2CH2]+N/D371(100)397(82)[RCO]+N/DN/D265(31)[M-90-153]+N/DN/D449(13)

注：N/D即未檢測到。

2.2 衍生條件優(yōu)化

分別研究衍生時(shí)間和衍生溫度對測定結(jié)果的影響。由于相關(guān)標(biāo)品短缺，不能對全部相關(guān)DAGs異構(gòu)體都進(jìn)行定量，因此即對所需異構(gòu)體總的峰面積進(jìn)行分析。由圖3可知，當(dāng)溫度一定時(shí)，衍生60 min達(dá)到穩(wěn)定。

a- 1,2-棕櫚酸二酯標(biāo)品衍生物峰；b-1,3-棕櫚酸二酯標(biāo)品衍生物峰；c-1,2-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰； d-1,3-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰；e-1,2-油酸二酯樣品衍生物峰；f-1,3-油酸二酯樣品衍生物峰；g-1,3-油酸二酯標(biāo)品衍生物峰圖2 DAG標(biāo)品及新鮮橄欖油樣品的GC-FID對比圖.Fig.2 GC-FID comparison of DAG standards and fresh virgin olive oil sample

圖3 新鮮初榨橄欖油在不同時(shí)間和溫度衍生下的DAGs衍生物總峰面積曲線圖Fig.3 The peak area of all DAGs derived from fresh virgin olive oil at different time and temperature

衍生時(shí)間均達(dá)到60 min時(shí)，溫度為20 ℃，衍生反應(yīng)不完全，溫度為30 ℃與60 ℃時(shí)，穩(wěn)定情況下峰面積無差異，衍生反應(yīng)完全。因此，在保證衍生劑過量的情況下，橄欖油的最佳衍生條件為：衍生60 min，溫度30 ℃。

2.3 GC分析甘油二酯

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取約0.1 g的1,3-油酸二酯、1,2-和1,3-棕櫚酸二酯混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1 mg，用甲苯溶解配制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液氮吹至干并進(jìn)行衍生反應(yīng)后，加丙酮復(fù)溶為1 mL，用分別用GC-MS與GC-FID進(jìn)行檢測后，以峰面積和質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由表2可知，GC-MS方法中1,2-棕櫚酸二酯、1,3-棕櫚酸二酯和1,3-油酸二酯在0.1～0.9 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.898，按信噪比S/N=3計(jì)算，檢出限分別為：0.015、0.013、 0.015 mg/mL。按信噪比S/N=10計(jì)算，定量限分別為：0.049、0.043、0.049 mg/mL。

GC-FID方法中1,2-棕櫚酸二酯、1,3-棕櫚酸二酯和1,3-油酸二酯的在0.1～0.9 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.981，按信噪比S/N=3計(jì)算，檢出限分別為：0.020、0.026、0.032 mg/mL。按信噪比S/N=10計(jì)算，定量限分別為：0.067、0.087、0.106 mg/mL。

GC-MS與GC-FID均可實(shí)現(xiàn)對DAGs異構(gòu)體的定量分析，均可滿足實(shí)驗(yàn)要求。GC-MS方法的檢出限和定量限更低，略優(yōu)于GC-FID。但本研究考慮到GC-FID可以大幅降低實(shí)驗(yàn)儀器成本，使實(shí)驗(yàn)方法更加具有實(shí)際操作性和可行性，便于大批量樣品的檢測，因此選擇利用FID進(jìn)行后續(xù)的定量分析。

表2 GC-MS與GC-FID對DAGs標(biāo)品的測定結(jié)果對比表Table 2 Determination result table of DAGs between GC-MS and GC-FID

2.3.2 GC-MS與GC-FID測定結(jié)果對比分析

采用GC-MS與GC-FID分別對5個(gè)初榨橄欖油樣品中1,3-油酸二酯含量進(jìn)行分析對比(見表3)，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)過T檢驗(yàn)，P<0.05，數(shù)據(jù)之間無顯著性差異，兩者均可用于初榨橄欖油中DAGs異構(gòu)體的精確定量分析。

表3 初榨橄欖油樣品中1,3-油酸二酯GC-FID與 GC-MS測定結(jié)果對比Table 3 Determination result of 1,3-DAG in olive oil samples by GC-MS and GC-FID

2.3.3 精密度分析

選取同一新鮮初榨橄欖油樣品，依照方法處理后，GC-FID進(jìn)樣。在1 d內(nèi)連續(xù)重復(fù)測量5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d重復(fù)測定，每次測3次取平均值，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表4。由表4可知，該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在1.35%～1.89%與2.33%～4.62%，并且對1,3-油酸二酯進(jìn)行定量分析，得到其1,3-油酸二酯日內(nèi)與日間平均值均為0.27 mg/mL(即2.7 mg/g)，RSD值分別為0.02%和0.04%。表明該方法測定橄欖油中DAGs異構(gòu)體含量精密度較好。

表4 方法日內(nèi)和日間精密度Table 4 The RSD for the inter- and intra-day

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同時(shí)取6份同種新鮮初榨橄欖油樣品，依照方法處理后，GC-FID進(jìn)樣，其出峰面積及RSD值見表5?？梢钥闯?，各種特征甘油二酯的峰面積RSD值在2.62%～5.71%，并且對1,3-油酸二酯進(jìn)行定量分析，得到其1,3-油酸二酯平均值為0.24 mg/mL(即2.4 mg/g)， RSD值為0.05%，前處理方法的穩(wěn)定性較好。

表5 6份同種橄欖油樣品的特征甘油二酯衍生物GC峰面積Table 5 GC peak area of characteristic DAGs in 6 same olive oil samples

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取已經(jīng)測定1,3-油酸二酯含量的新鮮初榨橄欖油樣品3份，分別加入0.1、0.5 和0.9 mg/mL的1,2-與1,3- 棕櫚酸二酯混標(biāo)以及1,3-油酸二酯單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品各1 mL，依照方法處理后，GC-FID進(jìn)樣。在表6中可以看出各甘油二酯的平均回收率在73.9%～76.9%。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)Table 6 Recovery experiment

注：N/D即未檢測到。

2.3.6 橄欖油樣品應(yīng)用初探

從意大利獲得6種特級初榨橄欖油和4種精煉橄欖油。用1.3的方法進(jìn)行前處理后，GC-FID進(jìn)樣并分析橄欖油中2種特征DAGs異構(gòu)體的含量。如圖4所示，新鮮初榨橄欖油中1,2-DAGs含量明顯均高于1,3-DAGs，精煉橄欖油中1,2-DAGs含量明顯均低于1,3-DAGs。

c-1,2-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰； d-1,3-油酸棕櫚酸二酯樣品衍生物峰；e-1,2-油酸二酯樣品衍生物峰；f-1,3-油酸二酯樣品衍生物峰圖4 不同橄欖油樣品的DAGs異構(gòu)體衍生物GC-FID圖Fig.4 GC-FID of DAGs isomers in different olive oil samples

分析2種特征DAGs異構(gòu)體的峰面積可知，新鮮初榨橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在0.41～0.61， 而精煉橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在2.04～2.39，這符合文獻(xiàn)[8]中對油脂1,3-DAGs與1,2-DAGs穩(wěn)定比例在6∶4～7∶3之間的描述，并且1,3-油酸二酯平均值為0.26 mg/mL(即2.6 mg/g)，RSD值為0.12%，符合文獻(xiàn)中[19]真實(shí)初榨橄欖油中1,3-油酸二酯的含量范圍，可以確定樣品的真實(shí)性及結(jié)果的可靠性。如圖5所示。

d/c-1,3-油酸棕櫚酸二酯與1,2-油酸棕櫚酸二酯比率；f/e-1,3-油酸二酯與1,2-油酸二酯比率圖5 橄欖油真實(shí)樣品中的1,3-DAGs/1,2-DAGs值分布圖Fig.5 The distribution of 1,3-DAGs /1,2-DAGs in olive oil authentic samples (d/c)1,3-palmitoyl-oldipalmitin/1,2-palmitoyl-oldipalmitin (f/e)1,3-diolein/1,2-diolein

將橄欖油中2種主要的特征DAGs異構(gòu)體的1,3-DAGs/1,2-DAGs結(jié)合來看，不同品質(zhì)的橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率差異明顯，并且甘油二酯異構(gòu)體比率的大小與橄欖油的新鮮程度呈正相關(guān)，由此可以作為區(qū)分壓榨橄欖油及精煉橄欖油的鑒別參考。

3 討論

本研究討論了橄欖油經(jīng)固相萃取后用甲基硅烷化試劑衍生，產(chǎn)生 1,2-DAGs與1,3-DAGs異構(gòu)體甲基硅烷化衍生物，用GC-FID法定量分析。通過試驗(yàn)得出最佳衍生條件為:衍生溫度30 ℃，衍生時(shí)間1 h。應(yīng)用外標(biāo)法定量，1,3-油酸二酯最低檢出限(S/N=3)為0.032 mg/mL，RSD值在1.35%～4.62%，各特征甘油二酯的平均回收率在73.9%～76.9%。利用本試驗(yàn)方法，測出來自意大利的真實(shí)初榨橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在0.41～0.61，精煉橄欖油中1,3-DAGs與1,2-DAGs的比率在2.04～2.39。 實(shí)現(xiàn)了利用GC-FID法對橄欖油中DAGs異構(gòu)體的定量分析，通過1,3-DAGs/1,2-DAGs的值來分析橄欖油品質(zhì)，并精確定量了6種初榨橄欖油中1,3-油酸二酯的含量，建立了對橄欖油中特定甘油二酯異構(gòu)體的定量分析方法。后續(xù)待進(jìn)一步檢測大量真實(shí)樣品與市售樣品驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用性。本研究的檢測方法對鑒別初榨橄欖油新鮮程度及真?zhèn)涡跃哂幸欢ǖ膮⒖家饬x，并且可以嘗試應(yīng)用到其他油類的品質(zhì)鑒定中。