T-2毒素對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2體外增殖和凋亡的影響

鮮婷婷，韓小敏，韓春卉，李鳳琴，徐文靜，張宏元，屠康

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095) 2(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

T-2毒素是由三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、擬枝飽鐮刀菌(F.sporotrichioides)、梨孢鐮刀菌(F.poae)和雪腐鐮刀菌(F.nivale)等多種鐮刀菌在特定條件下代謝產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物，具有毒性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熱及酸性條件下不易被破壞的特點(diǎn)[1-4]。T-2毒素廣泛分布于自然界，可污染農(nóng)作物和儲(chǔ)藏的谷物等，攝入被T-2毒素污染的谷物將嚴(yán)重影響動(dòng)物和人類的健康。研究表明，T-2毒素可對(duì)人和動(dòng)物的多個(gè)組織器官包括血液、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性效應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，T-2毒素對(duì)Wistar大鼠腎臟具有明顯損傷作用，T-2毒素灌胃后有尿血癥狀出現(xiàn)，病理切片檢查可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹(該部分結(jié)果尚未發(fā)表)。王麗華等[6]也發(fā)現(xiàn)低劑量T-2毒素在短時(shí)間內(nèi)可對(duì)腎臟造成損害，可引起腎近曲小管上皮細(xì)胞嗜酸性變和壞死、細(xì)胞核固縮，細(xì)胞器減少、基膜明顯增厚和部分線粒體髓樣變等。HK-2細(xì)胞是一種永生化的人腎小管上皮細(xì)胞，是研究腎毒性常用的細(xì)胞模型，目前尚未見(jiàn)到T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞毒性作用的研究，因此，本研究以體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞為模型，探討不同濃度的T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞增殖抑制、凋亡和周期分布等的影響，為闡明T-2毒素腎臟毒性作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HK-2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)。

T-2毒素(純度>98%)，青島普瑞邦生物工程有限公司；二甲基亞砜，德國(guó)Applichem公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素鏈霉素溶液，美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒，東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒、DNA Ladder抽提試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶(PI)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；熒光倒置顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；Gel Doc XR凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；萬(wàn)分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.3 方法

1.3.1 10 mmol/L T-2毒素儲(chǔ)備液的制備

準(zhǔn)確稱取0.010 g T-2毒素固體粉末，加入2 143.0 μL DMSO充分溶解后，置-20 ℃避光保存，備用。

1.3.2 HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(80%～90%匯合度)時(shí)，胰酶消化傳代并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞增殖抑制率的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×104個(gè)/mL，按4×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。取T-2毒素儲(chǔ)備液，用培養(yǎng)液分別配制終濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、250和500 nmol/L的毒素溶液，備用。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后棄去培養(yǎng)液，處理組每孔加入200 μL上述毒素溶液，對(duì)照組(含細(xì)胞)和空白組(不含細(xì)胞)加入200 μL培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1.5 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(A)，用公式(1)計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

(1)

式中，At為處理組的吸光度；Ab為空白組的吸光度；Ac為對(duì)照組的吸光度。

以細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，T-2毒素濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，用Graphpad prism 6.0擬合曲線并獲得HK-2細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(50% concentration of inhibition，IC50)。

1.3.4 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×104個(gè)/mL，按8×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液和2 mL細(xì)胞懸液。取T-2毒素儲(chǔ)備液，稀釋至濃度為20.0 nmol/L，備用。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后棄去培養(yǎng)液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對(duì)照組加入3 mL培養(yǎng)液，每組設(shè)2個(gè)平行孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，吸除培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min后去除固定液，用PBS洗滌2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min后置熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞DNA片段化的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，處理同1.3.4。取T-2毒素儲(chǔ)備液，用培養(yǎng)液分別配制終濃度為10.0、 20.0、30.0和40.0 nmol/L的毒素溶液，備用。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后棄去培養(yǎng)液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對(duì)照組加入3 mL培養(yǎng)液，每組設(shè)2個(gè)平行孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，吸除培養(yǎng)液至離心管，加入含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS洗滌培養(yǎng)板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS再次洗滌，離心棄上清，加入200 μL PBS重懸細(xì)胞。隨后按照DNA Ladder試劑盒操作提取DNA，具體如下：加入4 μL RNase A，降解RNA；加入20 μL蛋白酶K，降解蛋白質(zhì)；加入200 μL細(xì)胞裂解液，70 ℃水浴裂解細(xì)胞，釋放DNA；加入200 μL無(wú)水乙醇，沉淀DNA。將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA純化柱內(nèi)離心，洗滌液洗滌純化柱，除雜；加入洗脫液，溶解并洗脫DNA。將離心所得液體即純化的DNA進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DL15000+2000 marker作為對(duì)照，用凝膠成像儀拍照并觀察分析。

1.3.6 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡率的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/mL，按2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液和2 mL細(xì)胞懸液。取T-2毒素儲(chǔ)備液，用培養(yǎng)液分別配制終濃度為10.0、20.0、30.0和40.0 nmol /L 的毒素溶液，備用。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后棄去培養(yǎng)液，處理組每孔加入3 mL上述毒素溶液，對(duì)照組加入3 mL培養(yǎng)液，每組設(shè)2個(gè)平行孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，吸除培養(yǎng)液至離心管，加入不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS洗滌培養(yǎng)板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS再次洗滌，離心棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液混勻，室溫避光孵育10～20 min后用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)并分析結(jié)果。

1.3.7 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞周期分布的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，處理同1.3.6。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，吸除培養(yǎng)液至離心管，加入含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS洗滌培養(yǎng)板，收集液體，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS重懸，再次離心棄上清。加入1 mL預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇(體積分?jǐn)?shù))混勻，4 ℃固定過(guò)夜或-20 ℃固定1 h后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS重懸，再次離心棄上清。加入細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒提供的0.5 mL染色緩沖液、25 μL PI染色液和10 μL RNase A混勻，37 ℃避光溫浴30 min后用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，采用ModFit LT軟件分析結(jié)果。

1.3.8 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞caspase-3活性的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的HK-2細(xì)胞，細(xì)胞處理同1.3.6。 消化細(xì)胞后，4 ℃、600×g離心5 min，收集細(xì)胞，PBS重懸，離心棄上清。加入細(xì)胞裂解液，置于冰浴裂解15 min后，4 ℃、20 000×g離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的干凈離心管中。取5 μL加入預(yù)先加有250 μL考馬斯亮藍(lán)G250染色液的96孔板中，混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞的蛋白濃度。用裂解液調(diào)整樣品蛋白質(zhì)量濃度至1～3 g/L，取50 μL加入預(yù)先加有40 μL檢測(cè)緩沖液的96孔板中，隨后加入10 μL caspase-3反應(yīng)底物，混勻，37 ℃溫浴2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算caspase-3活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及各細(xì)胞周期細(xì)胞比例均以(x±s)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞的增殖抑制作用

四氮唑鹽比色法是目前應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的方法，它通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的氧化還原活性快速檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。CCK-8溶液中含有的水溶性四氮唑鹽WST-8可被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚，在450 nm處產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收峰，且生成的甲瓚數(shù)量和活細(xì)胞數(shù)目呈正比，而死細(xì)胞對(duì)四氮唑鹽不具有此轉(zhuǎn)化能力[7]。因此，測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而獲得T-2毒素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。將2.0、5.0、10.0、100、250和500 mmol/L T-2毒素濃度轉(zhuǎn)移為以10為底濃度對(duì)數(shù)后，經(jīng)Graphpad prism 6.0擬合后得到的HK-2細(xì)胞增殖抑制曲線如圖1所示，20.0 nmol/L T-2毒素作用HK-2細(xì)胞72 h后即可抑制細(xì)胞增殖，抑制率為18.63%，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且細(xì)胞的抑制率隨T-2毒素濃度的增大而上升，當(dāng)濃度增大至250 nmol/L時(shí)，T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞的抑制率可達(dá)84.32%。結(jié)果表明，T-2毒素在20～250 nmol/L可以明顯抑制HK-2細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。此外T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞的IC50值為(49.34±1.33) nmol/L。因此，選取10.0、20.0、30.0和40.0 nmol /L作為T(mén)-2毒素作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 HK-2細(xì)胞增殖抑制曲線Fig.1 Proliferation inhibition curve of HK-2 cells

2.2 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)特征，包括細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密；染色質(zhì)逐漸凝聚成新月?tīng)罡接诤四ぶ苓叄患?xì)胞核固縮呈均一的致密物；細(xì)胞膜出芽突起，隨后形成大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體等[8]。Hoechst 33258藍(lán)色熒光染料可穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞DNA雙鏈中的小溝結(jié)合，使細(xì)胞核著色。正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完好，通透性差，染色質(zhì)分布均勻；而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，染色質(zhì)固縮。因此，經(jīng)Hoechst 33258染色后，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色弱熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光[9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組HK-2細(xì)胞形態(tài)完整，邊緣光滑，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核染色顏色較淺(圖2-A)；20.0 nmol/L T-2毒素處理組細(xì)胞細(xì)胞核染色較深，染色質(zhì)固縮，呈碎塊狀或新月體狀的強(qiáng)藍(lán)色熒光(圖2-B)。

A-對(duì)照組；B-20.0 nmol/L圖2 HK-2細(xì)胞Hoechst 33258染色形態(tài)Fig.2 The Hoechst 33258 staining morphology of HK-2 cells

2.3 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞DNA片段化的影響

細(xì)胞凋亡晚期染色質(zhì)固縮，Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活使得染色質(zhì)DNA在核小體單位之間斷裂，形成大小50～300 kb的DNA片段，進(jìn)一步分解成約180～200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段[10]，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可觀察到梯形條帶(DNA Ladder)出現(xiàn)。因此DNA片段化被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡最直觀便捷的方法[11]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和T-2毒素處理組細(xì)胞凝膠電泳均未見(jiàn)DNA Ladder出現(xiàn)，這說(shuō)明10～40 nmol/L T-2毒素作用HK-2細(xì)胞72 h后未出現(xiàn)晚期凋亡或者晚期凋亡不明顯。

圖3 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞DNA片段化的影響Fig.3 Effect of T-2 toxin on DNA fragmentation of HK-2 cells

2.4 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)分布著磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻，暴露于細(xì)胞膜外表面。而Annexin是一類分布于真核細(xì)胞漿內(nèi)的磷脂結(jié)合蛋白，與PS具有高度親和力，用綠色熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC就可檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)合PI可檢測(cè)壞死細(xì)胞這一特征，就可區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HK-2細(xì)胞經(jīng)T-2毒素作用72 h后可使(3.84±1.61)%，(10.78±1.83)%，(17.28±7.19)%，(30.40±7.05)%的細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，(3.85±1.46)%，(7.57±2.82)%，(4.84±1.76)%，(8.52±1.38)%的細(xì)胞出現(xiàn)晚期凋亡，處理組早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例均高于對(duì)照組早期凋亡(2.17±0.12)%和晚期凋亡(3.55±0.82)%的比例。此外，不同濃度作用后總凋亡細(xì)胞的比例分別為7.69%，18.35%，22.12%和38.92%，均高于對(duì)照組總凋亡細(xì)胞比例5.72%，且總凋亡細(xì)胞比例隨毒素濃度的增加而上升。由此可見(jiàn)，T-2毒素可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且主要為早期凋亡，這也與本研究發(fā)現(xiàn)的T-2毒素作用HK-2 細(xì)胞后未出現(xiàn)DNA Ladder實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

A-對(duì)照；B-10 nmol/L；C-20 nmol/L；D-30 nmol/L：E-40 nmol/LUL-死細(xì)胞；UR-晚期凋亡細(xì)胞；LL-活細(xì)胞；LR-早期凋亡細(xì)胞圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of HK-2 cells detected by flow cytometry

表1 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Effect of on T-2 toxin on apoptosis of HK-2 cells

T-2毒素濃度/(nmol·L-1)細(xì)胞比例/%活細(xì)胞死細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞總凋亡細(xì)胞對(duì)照93.41±0.58a0.87±0.13b2.17±0.12a3.55±0.82a5.72c1089.33±0.64ab2.99±2.43ab3.84±1.61b3.85±1.46a7.69c2080.36±4.84b1.30±0.19ab10.78±1.83bc7.57±2.82b18.35b3068.38±9.42b9.5±4.2a17.28±7.19c4.84±1.76b22.12b4054.24±8.80c6.85±3.11a30.40±7.05c8.52±1.38b38.92a

注：同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.5 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞周期分布的影響

利用PI可與細(xì)胞雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比這一特性，可用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，HK-2細(xì)胞經(jīng)T-2毒素作用72 h后，G0/G1期細(xì)胞比例分別由對(duì)照組的(64.50±3.00)%降低至(56.17±2.09)%，(54.78±1.31)%，(53.62±1.41)%和(52.40±1.37)%；S期細(xì)胞比例分別由對(duì)照組的(24.58±2.29)%增加至(30.19±1.36)%，(32.03±0.64)%，(31.25±0.66)%和(31.98±0.50)%；G2/M期細(xì)胞比例分別由對(duì)照組的(10.92±0.95)%增加至(13.65±1.34)%，(13.19±0.83)%，(15.14±1.01)%和(15.62±0.90)%?？梢?jiàn)不同濃度T-2毒素作用細(xì)胞72 h后可影響HK-2細(xì)胞的周期分布，使G0/G1期細(xì)胞比例顯著下降，而S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，引起細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

表2 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞周期的影響Table 2 Effect of T-2 toxin on cell cycle of HK-2 cells

2.6 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞caspase-3活性的影響

caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。正常細(xì)胞內(nèi)caspase-3存在于胞漿中，不具活性，但在凋亡的早期階段該蛋白可被家族中其他成員激活，裂解相應(yīng)的底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。

圖5 T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞caspase-3活性的影響Fig.5 Effect of T-2 toxin on caspase-3 activity of HK-2 cells注：* 表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

從圖5可知，與對(duì)照組相比，HK-2細(xì)胞分別經(jīng)10.0、20.0、30.0、40.0 nmol/L的T-2毒素作用72 h后，處理組細(xì)胞中caspase-3活性分別提高到1.15、1.53、 1.53和1.93倍，具有正的劑量依賴效應(yīng)。

3 討論

T-2毒素作為單端孢霉烯族化合物中毒性最強(qiáng)的毒素，主要污染谷物及加工飼料。李思齊等[14]對(duì)魯北地區(qū)18家養(yǎng)殖場(chǎng)的全株玉米青貯飼料中霉菌毒素含量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，T-2毒素檢出率為100%。杜妮[15]對(duì)2013～2017年全國(guó)12個(gè)省份的玉米、豆粕、小麥、麩皮和飼料中霉菌毒素污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，T-2毒素陽(yáng)性檢出率為66.85%～90.13%，平均值為38.9～49.9 μg/kg，污染程度較高，攝入風(fēng)險(xiǎn)較大。因此很多國(guó)家和地區(qū)制定了T-2毒素限量標(biāo)準(zhǔn)[16]，如加拿大提出豬和家禽飼料中T-2毒素建議容忍限量為1 000 μg/kg，我國(guó)在《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)中規(guī)定植物性飼料原料和豬、禽配合飼料的最大允許量為0.5 mg/kg。因此，開(kāi)展T-2毒素毒性研究可以為降低T-2毒素危害提供理論依據(jù)。

本研究CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞具有增殖抑制作用，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道的T-2對(duì)體外培養(yǎng)的人和動(dòng)物細(xì)胞增殖影響的結(jié)果相一致[17-18]，表明T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞具有毒性作用。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)復(fù)雜而有序并受?chē)?yán)格調(diào)控的過(guò)程，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂在細(xì)胞損傷乃至癌變過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而細(xì)胞增殖也是通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期的運(yùn)行是在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint)的嚴(yán)格監(jiān)控下進(jìn)行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將發(fā)生阻滯，使細(xì)胞在復(fù)制前(G0/G1期阻滯)和有絲分裂前(G2/M期阻滯)有足夠的時(shí)間進(jìn)行有效的修復(fù)，修復(fù)成功的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，修復(fù)失敗的細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，因此細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞増殖、調(diào)亡及基因組穩(wěn)定性有重要作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度T-2毒素作用HK-2細(xì)胞72 h后可影響細(xì)胞的周期分布，引起細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，但AGRAWAL等[21]研究發(fā)現(xiàn)T-2毒素可誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期停滯，兩項(xiàng)研究均表明T-2毒素可引起細(xì)胞周期阻滯，但其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明T-2毒素作用可引起HK-2細(xì)胞凋亡，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；Hoechst 33258熒光染色也發(fā)現(xiàn)T-2毒素作用HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)碎片和固縮現(xiàn)象，熒光染色增強(qiáng)，部分細(xì)胞可以觀察到明顯的凋亡小體，說(shuō)明T-2毒素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與YUAN等[22]報(bào)道的T-2毒素對(duì)TM3細(xì)胞凋亡和WU等[23]報(bào)道熒光染色觀察結(jié)果相一致。DNA片段化也是伴隨細(xì)胞凋亡的主要生化特征，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可觀察到特征性的梯形條帶。但另有研究發(fā)現(xiàn)DNA凝膠電泳雖特異性高但靈敏度低，不能檢測(cè)DNA輕微損傷及早期凋亡，且并不是所有細(xì)胞凋亡都有DNA Ladder出現(xiàn)，取決于細(xì)胞類型和一些特殊情況(如凋亡細(xì)胞DNA雙鏈斷裂時(shí)可觀察到梯形條帶，而單鏈斷裂時(shí)則觀察不到)[24]。本研究在HK-2細(xì)胞的對(duì)照組及處理組中均沒(méi)有觀察到DNA Ladder，結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可知，T-2毒素確實(shí)可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的早期凋亡。細(xì)胞凋亡是多基因調(diào)控下的復(fù)雜的主動(dòng)死亡過(guò)程，其中caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的caspase家族成員有14個(gè)，根據(jù)caspase氨基酸序列的同源性及其作用性質(zhì)主要分為3個(gè)亞型，分別作為細(xì)胞凋亡的活化者、執(zhí)行者和炎癥介質(zhì)反應(yīng)的調(diào)節(jié)者參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程[13]，其中caspase-3就屬于細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶在細(xì)胞內(nèi)存在的兩條凋亡途徑：外源性凋亡途徑和線粒體途徑中均發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)T-2毒素作用HK-2細(xì)胞后caspase-3活性明顯升高，這也與LIU等[25]報(bào)道的T-2毒素可通過(guò)caspase-3活化引起GH3細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。

綜上所述，T-2毒素對(duì)HK-2細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，能夠誘導(dǎo)HK-2發(fā)生G2/M期阻滯，同時(shí)通過(guò)激活caspase-3活性而誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，有關(guān)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。