阻斷輔因子NADPH合成對(duì)谷氨酸棒桿菌生長及產(chǎn)物合成的影響

楊漢昆，徐建中*，張偉國*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)又稱為還原型輔酶Ⅱ，在很多生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)中起遞氫體的作用，具有重要的生物學(xué)意義。NADPH在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，通過參與800多個(gè)氧化還原反應(yīng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平并影響著眾多基因表達(dá)、細(xì)胞功能、代謝途徑和物質(zhì)跨膜運(yùn)輸[1]，參與多種合成代謝反應(yīng)，如氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成均需要NADPH提供還原力，對(duì)細(xì)胞正常生長和代謝有重要影響[2]，并且是微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中含量最豐富的氧化還原輔酶之一。胞內(nèi)NADPH的生成和消耗同胞內(nèi)很多重要的代謝途徑相關(guān)聯(lián)，維持細(xì)胞內(nèi)輔酶的平衡對(duì)于細(xì)胞生長、代謝以及產(chǎn)物的合成都非常關(guān)鍵。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是另一種極為重要的核苷酸類輔酶，是代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵輔因子之一,在胞內(nèi)參與超過300個(gè)氧化還原反應(yīng)[3]。如在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)以及呼吸鏈等代謝中發(fā)揮著不可替代的作用[4-6]。NADH/NAD+這對(duì)輔因子在葡萄糖分解代謝中起著核心作用，以NAD+作為輔因子將葡萄糖氧化，并且NAD+同時(shí)轉(zhuǎn)化成等量的NADH還原形式。

NADPH對(duì)谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)合成L-賴氨酸非常重要，根據(jù)C.glutamicumL-賴氨酸合成代謝網(wǎng)絡(luò)可知有4個(gè)反應(yīng)涉及NADPH的消耗，即合成1 molL-賴氨酸需要消耗4 mol NADPH[7]。研究結(jié)果表明在谷氨酸棒桿菌中NADPH的供應(yīng)與消耗是不平衡的。在谷氨酸棒桿菌中分別由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸酶和異檸檬酸脫氫酶以NADP+為輔因子，參與NADPH合成[8-9]。谷氨酸棒桿菌中的NADPH不僅要滿足L-賴氨酸合成需求而且還要用于菌體生長。因?yàn)?，增?g菌體需要消耗16.4 mmol NADPH[10]。目前的研究主要集中于通過輔因子工程提高NADPH的供應(yīng)可以強(qiáng)化L-賴氨酸合成，而對(duì)阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑對(duì)菌體生長及產(chǎn)物合成的影響研究匱乏。胞內(nèi)NADPH水平可以改變胞內(nèi)微環(huán)境，CHEN等[11]指出，改變胞內(nèi)NADPH水平會(huì)擾動(dòng)胞內(nèi)的氧化還原水平和ATP含量；同時(shí)也會(huì)影響目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，XU等[12]通過在谷氨酸棒桿菌中異源表達(dá)大腸桿菌膜結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶PntAB來改變胞內(nèi)NADPH水平，能夠影響谷氨酸棒桿菌合成L-賴氨酸的能力。氧化還原輔因子代謝工程成為優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化的重要代謝工程策略[13]。在谷氨酸棒桿菌中，研究表明L-賴氨酸的合成與輔因子NADPH水平密切相關(guān)[1]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumLYS為出發(fā)菌株，敲除參與胞內(nèi)NADPH合成的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶編碼基因，并將自身NADP+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(icdCg)替換成變形鏈球菌(Streptococcusmutans)NAD+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(icdSm)。對(duì)出發(fā)菌C.glutamicumLYS和重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，分析阻斷谷氨酸棒桿菌中NADPH合成途徑對(duì)胞內(nèi)NAD+、NADH、ATP、ADP和AMP、細(xì)胞生長、葡萄糖消耗速率、L-賴氨酸、有機(jī)酸以及其他副產(chǎn)物氨基酸合成的影響。為進(jìn)一步研究NADPH調(diào)控L-賴氨酸產(chǎn)生菌胞內(nèi)微環(huán)境的生理機(jī)制，調(diào)控和優(yōu)化胞內(nèi)NADPH與中心碳代謝的特異性，為改進(jìn)微生物L(fēng)-賴氨酸生產(chǎn)性能提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

C.glutamicumLYS、E.coliJM109,穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDXW-8和敲除質(zhì)粒pK18mobsacB均為本研究室保藏，其他質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XbaⅠ、Hind Ⅲ、SalⅠ、EcoR Ⅰ，T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker：購于寶生物工程有限公司；PCR相關(guān)試劑、基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒：購于上海生工生物工程有限公司;輔酶Ⅱ NADP(H)和NAD(H)含量檢測試劑盒:購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

UV 2100可見紫外分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JY 1600C凝膠水平電泳儀，北京六一儀器廠；SBA40-E生物傳感儀，山東省科學(xué)院生物研究所；G1-14高速離心機(jī)，Sigma公司；Gel DOC GR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；LC 1100高效液相色譜系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司；Gene Pulser Xcell電穿孔儀，美國Bio-Rad公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10,pH 7.0。

LBG培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10,葡萄糖 5，pH 7.0。

Epo培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 5， 蛋白胨 10， 酵母膏 5， NaCl 10， 吐溫-80 1， pH 7.0，121 ℃滅菌20 min， 滅菌后加入無菌的異煙肼4 g和甘氨酸30 g，用于制備C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞。

LBHIS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 5，酵母膏 2.5，NaCl 10，腦心浸出液 18.5，山梨醇 91，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，用于C.glutamicum轉(zhuǎn)化子的恢復(fù)和生長。

種子培養(yǎng)基(g/L)：豆粕水解1.25，(NH4)2SO42，蔗糖 25，KH2PO41， MgSO4·7H2O 0.4，乙酸銨 6，F(xiàn)eSO40.01，MnSO40.01，煙酰胺 0.005，味精 0.1，硫胺素0.000 2，生物素0.000 5，121 ℃滅菌20 min，500 mL三角瓶裝液量50 mL，30 ℃、100 r/min培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40，(NH4)2SO436，MgSO4·7H2O 1.5，F(xiàn)eSO40.02，MnSO40.02，KH2PO41，K2HPO41，玉米漿 35，甜菜糖蜜 12，煙酰胺 0.008，甜菜堿0.05，硫胺素0.000 45，生物素0.000 85，CaCO340，pH 7.0，115 ℃滅菌10 min。5 mL種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的搖瓶中，30 ℃、 100 r/min發(fā)酵40 h。

1.1.4 PCR引物序列

基于NCBI數(shù)據(jù)庫中C.glutamicumATCC 13032基因組序列設(shè)計(jì)用于各基因敲除框的擴(kuò)增和驗(yàn)證引物，基于StreptococcusmutansJH1005基因組設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增置換基因的引物。如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞內(nèi)NADPH合成相關(guān)基因的敲除載體pK18-mobsacB-Δzwf、pK18mobsacB-ΔmalE的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中C.glutamicumATCC 13032基因序列設(shè)計(jì)zwf基因上下游以及中間引物，引物序列如表1。提取C.glutamicumATCC 13032基因組為模板，分別以zwf-L-F/zwf-L-R和zwf-R-F/zwf-R-R為引物PCR，獲得分別在3’端和5’端有相同限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物zwf-L、zwf-R。將膠回收后的基因片段zwf-L和重組自殺型質(zhì)粒載體pK18mobsacB通過HindIII和SalI雙酶切，純化后將zwf-L和線性化質(zhì)粒pK18mobsacB22 ℃過夜酶連，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，經(jīng)抗性平板篩選，挑取轉(zhuǎn)化子菌落PCR，選取較亮條帶對(duì)應(yīng)的單菌落液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，構(gòu)建質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf-L。用同樣的方法將基因片段zwf-R連接至質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf-L上構(gòu)建重組自殺型質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf。通過相同的方法構(gòu)建質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔmalE。

表1 PCR擴(kuò)增所需引物序列Table 1 Primer sequences required for PCR amplification

注：下劃線為酶切位點(diǎn)。

1.2.2 胞內(nèi)NADPH合成相關(guān)基因的置換載體pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm的構(gòu)建

通過1.2.1中的方法構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg。

根據(jù)NCBI中StreptococcusmutansJH1005全基因組核酸序列中的icd基因序列，在其基因上下游分別加入限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI酶切位點(diǎn)序列并在上游加入谷氨酸棒桿菌SD識(shí)別序列GAAAGGAGATATACC，并將組合好的序列提交給通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行合成，獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒pUC57-icdSm。

采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI酶切重組質(zhì)粒pUC57-icdSm。隨后采用膠回收試劑盒回收icdSm片段。將icdSm片段與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDXW-8相連構(gòu)建重組質(zhì)粒pDXW-8-icdSm。

根據(jù)表達(dá)質(zhì)粒pDXW-8基因序列設(shè)計(jì)包含啟動(dòng)子Ptac和終止子rrnBT1T2基因上下游引物，引物序列如表1。以pDXW-8-icdSm模板，以Ptac-F/Ptac-R為引物進(jìn)行PCR，獲得Ptac-icdSm-rrnBT1T2表達(dá)框。隨后將純化后的PCR產(chǎn)物Ptac-icdSm-rrnBT1T2與pK18mobsacB-ΔicdCg用SalI單酶切，酶切產(chǎn)物純化后酶連，獲得在icdCg左右同源臂間插入icdSm基因，構(gòu)建基因置換質(zhì)粒K18mobsacB-ΔicdCg::icdSm。

1.2.3 重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm的構(gòu)建

1.2.4 胞內(nèi)輔酶Ⅱ NADP(H)的測定[16]

收集400～500萬細(xì)菌，加入0.9 mL酸性(堿性)提取液，超聲破碎1 min(200W，超聲2 s，停1 s)，蓋緊后煮沸5 min，冰浴中冷卻后，10 000×g4 ℃離心10 min，取上清液200 μL至另一新的離心管中，加入等體積的堿性(酸性)提取液使之中和，10 000×g、4 ℃離心10 min，取上清。隨后，以試劑盒NADP/NADPH Quantification Colorimeteric Kit特異性檢測NADP+和NADPH，并計(jì)算NADPH /NADP+。

1.2.5 胞內(nèi)輔酶Ⅰ NAD(H)的測定[16]

收集500萬細(xì)菌，加入0.5 mL酸性(堿性)提取液，超聲破碎1 min(200W，超聲2 s，停1 s)， 蓋緊后煮沸5 min，冰浴中冷卻后，10 000×g4 ℃離心10 min，取上清液200 μL至另一新的離心管中，加入等體積的堿性(酸性)提取液使之中和，10,000×g、4 ℃離心10 min， 取上清。隨后，以試劑盒NAD/NADH Quantification Colorimeteric Kit特異性檢測NAD+和NADH，并計(jì)算NADH/NAD+。

1.2.6 重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm和出發(fā)菌C.glutamicumLYS胞內(nèi)ATP、ADP、AMP的測定[17]

利用0.6 mol/L HClO4(PCA)抽提重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm和出發(fā)菌C.glutamicumLYS胞內(nèi)ATP、ADP和AMP。隨后，采用HPLC技術(shù)對(duì)抽提液進(jìn)行分析，測定胞內(nèi)ATP、ADP和AMP的濃度。將50 mL細(xì)胞樣品從培養(yǎng)物中取出，立即在液氮中冷凍60 s，并儲(chǔ)存在-20 ℃。通過HPLC測量細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度。為了提取ATP，將10 mL 的0.6 mol/L HClO4加入到細(xì)胞沉淀中并混合用磁力攪拌器徹底攪拌10 min。將混合物以10 000×g離心10 min以收集上清液。將另外10 mL的0.6 mol/L HClO4加入到沉淀中，充分混合10 min，離心后收集上清液。將兩部分上清液在25 mL容量瓶中混合并用0.6 mol/L HClO4補(bǔ)足至25 mL。取10 mL所制備的溶液，并用0.8 mol/L KOH將pH值調(diào)節(jié)至7.0。在4 ℃保持30 min后，通過過濾從孔中除去晶體KClO4(孔徑=0.22 μm)，然后在應(yīng)用HPLC柱之前用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋至25 mL。 HPLC分析的進(jìn)樣量為10 μL。使用80%10 mmol/L KH2PO4(pH 7.0)和20%甲醇的混合物作為流動(dòng)相，流速為1.2 mL/min。紫外檢測器的波長設(shè)置為260 nm， 柱溫控制在25 ℃。

1.2.7 分析方法

菌體濃度測定：將發(fā)酵液稀釋26倍，測定562 nm處的吸光值。

葡萄糖測定：將發(fā)酵液離心(9,000×g，2 min)除去菌體和CaCO3，然后稀釋100倍，經(jīng)生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測定[18]。

氨基酸含量測定：發(fā)酵液中氨基酸含量的測定采用氨基酸自動(dòng)分析儀[19]。

搖瓶發(fā)酵出發(fā)菌株C.glutamicumLYS和重組菌株C.glutamicumLYS ΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm，發(fā)酵期間定時(shí)取樣測定發(fā)酵液實(shí)時(shí)葡萄糖含量、菌體量和L-賴氨酸產(chǎn)量并繪制過程曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體和重組菌株的構(gòu)建

2.1.1 胞內(nèi)NADPH合成相關(guān)基因的敲除載體pK18mobsacB-Δzwf、pK18mobsacB-ΔmalE的構(gòu)建

E.coliJM109 pK18mobsacB-Δzwf擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒分別用BamH I +XbaI和Hind Ⅲ +XbaI雙酶切驗(yàn)證基因zwf左右同源臂，從酶切電泳結(jié)果圖1泳道3、4可以看出，酶切后的左右同源臂片段大小約為900 bp， 與理論大小相符。E.coliJM109 pK18mobsacB-ΔmalE擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒分別用Hind Ⅲ +SalI和XbaI +SalI雙酶切驗(yàn)證基因malE左右同源臂，從酶切電泳結(jié)果圖1泳道1、2可以看出，酶切后的左右同源臂片段大小約為900 bp，與理論大小相符。

M-DL5000 Marker;1-質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔmalE Xba I+Sal I雙酶切產(chǎn)物，右同源臂；2-質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔmalE HindIII + Sal I雙酶切產(chǎn)物，左同源臂；3-質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf HindIII + Xba I雙酶切產(chǎn)物，右同源臂；4-質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf BamH I + Xba I雙酶切產(chǎn)物，左同源臂圖1 質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf、質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔmalE左右同源臂雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Enzyme digestion of the recombinant plasmid pK18mobsacB-Δzwf and pK18mobsacB-ΔmalE

2.1.2 胞內(nèi)NADPH合成相關(guān)基因的置換載體pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm的構(gòu)建

E.coliJM109 pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，由于驗(yàn)證時(shí)沒有合適的酶切位點(diǎn)，只能通過質(zhì)粒PCR驗(yàn)證基因icdCg左右同源臂和置換基因icdSm，從PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖2泳道1可以看出基因icdSm片段大小約為1 600 bp，與理論大小相符，從泳道2、3可以看出，左右同源臂片段大小約為900 bp，與理論大小相符。

M-DL5000 Marker;1-質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm icdSm基因PCR產(chǎn)物；2-質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm右同源臂PCR產(chǎn)物； 3-質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm左同源臂PCR產(chǎn)物圖2 質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm各片段PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR analysis of the recombinant plasmid pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm

2.1.3 重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm的構(gòu)建

將篩選到的C.glutamicumLYSΔzwf、C.glutamicumLYSΔzwfΔmalE、C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后，分別對(duì)應(yīng)以zwf、malE、icd基因上下游引物進(jìn)行PC鑒定篩選完成二次同源重組菌株，從PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖3泳道1可以看出基因icd置換片段大小約為2 391 bp，與理論大小相符，泳道2、3可以看出基因malE、zwf敲除型殘余片段大小約為599、895 bp，與理論大小相符。各PCR產(chǎn)物測序比對(duì)結(jié)果也與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)吻合，最終鑒定正確的轉(zhuǎn)化子命名為C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm。

M-DL5000 Marker;1-基因icd置換型PCR產(chǎn)物；2-基因malE敲除型PCR產(chǎn)物；3-基因zwf敲除型PCR產(chǎn)物圖3 重組菌PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR analysis of the recombinant strain

2.2 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP和AMP)、吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)的變化

為了確定C.glutamicumLYS在敲除zwf、malE基因和替換icd基因后的重組菌是否成功阻斷胞內(nèi)NADPH的合成量，本文對(duì)于出發(fā)菌和重組菌搖瓶發(fā)酵40 h后對(duì)其胞內(nèi)吡啶核苷酸含量進(jìn)行測定，具體數(shù)據(jù)如表2。

表2 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)含量Table 2 Contents of intracellular pyridine nucleotides (NAD+, NADH, NADP+ and NADPH) in recombinant and original bacteria

注：a:單位是μmol/g DCW。表3同。

從表2可以看出重組菌C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm胞內(nèi)NADH含量由出發(fā)菌的1.97 μmol/g DCW增加到2.73 μmol/g DCW，胞內(nèi)的NADH/NAD+提高了53.84%，NADPH含量降低了89.51%，在該酶的催化下和出發(fā)菌株相比不再合成NADPH而合成更多的NDAH，說明自身NADP+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(icdCg)替換成變形鏈球菌(Streptococcusmutans)NAD+-依賴型異檸檬酸脫氫酶基因(icdSm)，實(shí)現(xiàn)了輔酶依賴型的轉(zhuǎn)變；胞內(nèi)NADPH含量降低至0.15 μmol/g DCW，明顯低于出發(fā)菌胞內(nèi)NADPH含量1.43 μmol/g DCW。胞內(nèi)的NADPH/NADP+降低了93.13%，胞內(nèi)少量的NADPH，可能是由于阻斷了胞內(nèi)NADPH的合成，NAD(H)/NADP(H)失去平衡后，NAD激酶開始發(fā)生作用，使得少量的NADH被NAD激酶催化形成NADPH[24]。谷氨酸棒桿菌體內(nèi)還有多個(gè)涉及NADPH代謝反應(yīng)沒有發(fā)現(xiàn)，如呼吸鏈中NADPH氧化酶的作用[25]。表3可以看出胞內(nèi)ATP含量降低了13.1%，阻斷了胞內(nèi)NADPH的合成，即敲除了PPP途徑和改變了異檸檬酸脫氫酶的輔酶依賴型后不再合成NADPH， NADPH的急劇降低致使經(jīng)過電子傳遞鏈氧化生成的ATP也在一定程度上被削弱，胞內(nèi)ADP和AMP無法及時(shí)轉(zhuǎn)換成ATP，均有一定程度累積，擾亂了胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸平衡。

表3 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸 (ATP、ADP和AMP)含量Table 3 Contents of intracellular adenine nucleotides (ATP, ADP and AMP) in recombinant and original bacteria

2.3 阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑對(duì)葡萄糖消耗速率和菌體生長的影響

由圖4可知出發(fā)菌和重組菌的生長趨勢基本保持一致，但重組菌的生長較為緩慢，生長速率偏低，在相等OD562相同的接種量下，菌體延滯期基本相同，而菌體的對(duì)數(shù)生長期延長約4 h。由圖5可知在發(fā)酵過程的12～24 h，主要在菌體的對(duì)數(shù)生長期重組菌的葡萄糖代謝能力明顯弱于出發(fā)菌株。

圖4 出發(fā)菌和重組菌株菌體生長曲線Fig.4 Growth curve of the oringinal and recombinant strains

圖5 出發(fā)菌和重組菌株葡萄糖消耗速率Fig.5 Glucose consumption rate of the oringinal and recombinant strains

由于戊糖磷酸途徑是糖代謝的第二條重要途徑同樣也是細(xì)胞產(chǎn)生還原力(NADPH)的主要途徑，敲除了合成NADPH的PPP途徑，胞內(nèi)NADPH銳減，減緩胞內(nèi)各種需要NADPH的合成反應(yīng)，如氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成，對(duì)細(xì)胞正常生長和代謝有重要影響，發(fā)酵結(jié)束后重組菌菌體量與出發(fā)菌相比降低了4.36%。阻斷了葡萄糖進(jìn)入PPP途徑，葡萄糖代謝途徑減少致使葡萄糖的代謝減緩。胞內(nèi)的NADH/NAD+提高了53.84%，更高的NADH/NAD+比率不利于糖酵解的進(jìn)行，致使重組菌的葡萄糖代謝能力進(jìn)一步削弱。胞內(nèi)NAD激酶發(fā)生作用，形成少量的NADPH優(yōu)先供應(yīng)細(xì)胞生長，致使阻斷胞內(nèi)L-賴氨酸合成通路中NADPH的合成，對(duì)菌體生長影響相對(duì)較小，而對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量等代謝產(chǎn)物影響較大。菌體生長也因葡萄糖代謝減緩而受到一定程度的影響。而NADPH也會(huì)影響胞內(nèi)微環(huán)境，如NAD(H/+)狀態(tài)和ATP含量，由于ATP可調(diào)節(jié)胞內(nèi)pHi，提高細(xì)胞對(duì)酸脅迫的適應(yīng)力，NADPH可通過NADPH氧化酶阻止胞內(nèi)羥基等活性氧簇(ROS)的形成，提高細(xì)胞對(duì)氧脅迫的適應(yīng)力[26]。而阻斷了NADPH合成途徑導(dǎo)致胞內(nèi)微環(huán)境擾亂，有可能間接性的影響到菌體生長和葡萄糖代謝。

2.4 阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑對(duì)L-賴氨酸合成的影響

由圖6可知，40 h發(fā)酵結(jié)束后出發(fā)菌C.glutamicumLYS發(fā)酵液中L-賴氨酸含量為6.5 g/L，重組菌C.glutamicumLYS ΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm，L-賴氨酸產(chǎn)量為0.8 g/L，與出發(fā)菌相比，阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑胞內(nèi)的NADPH降低了89.51%，L-賴氨酸產(chǎn)量降低了87.69%。

圖6 搖瓶培養(yǎng)條件下出發(fā)菌和重組菌株L-賴氨酸產(chǎn)量Fig.6 L-lysine yield of the oringinal and recombinant strains in shake flask culture

敲除了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因使得PPP途徑失活“C”通量減少，TCA循環(huán)“C”通量增加，蘋果酸酶編碼基因敲除和異檸檬酸脫氫酶由于基因置換導(dǎo)致輔酶依賴型的改變使得胞內(nèi)NADPH含量降低至0.15 μmol/g DCW。在發(fā)酵12 h后，出發(fā)菌和重組菌的菌體量開始出現(xiàn)較大的差距，同時(shí)L-賴氨酸含量也開始出現(xiàn)很明顯的差距，結(jié)果表明此時(shí)由于重組菌無法滿足菌體生長和L-賴氨酸合成所需的NADPH，導(dǎo)致菌體生長緩慢，菌體量減少，并且在L-賴氨酸合成途徑中谷草轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶或琥珀酰-氨基-吡咯酮轉(zhuǎn)氨酶需要以NADPH為輔酶，合成1分子L-賴氨酸需要4分子的NADPH，NADPH的嚴(yán)重缺乏，加劇了L-賴氨酸的產(chǎn)量的降低。大量研究表明,L-賴氨酸產(chǎn)量的增加與增加PPP途徑“C”通量和減少TCA循環(huán)“C”通量密切相關(guān)。

2.5 阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑對(duì)副產(chǎn)物合成的影響

很多氨基酸的合成都依賴于NADPH，為了進(jìn)一步研究阻斷胞內(nèi)NADPH合成途徑對(duì)發(fā)酵副產(chǎn)物如有機(jī)酸和其他氨基酸的影響，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中有機(jī)酸和副產(chǎn)物氨基酸含量。

由表4可以看出由于阻斷了胞內(nèi)NADPH合成途徑出發(fā)菌C.glutamicumLYS和重組菌C.glutamicumLYS ΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm發(fā)酵液中的副產(chǎn)物氨基酸明顯降低，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸較出發(fā)菌株分別降低了76.94%、79.22%、 83.09%、80.87%、62.25%，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸的合成都需要提供輔因子NADPH，致使合成產(chǎn)量都明顯降低，而由于合成谷氨酸所需要的輔因子NADPH相對(duì)較低，對(duì)其生物合成的影響相比其他氨基酸而言相對(duì)較低，而賴氨酸合成需要更多的輔因子NADPH，致使其產(chǎn)量降低的最為明顯。

表4 重組菌和出發(fā)菌發(fā)酵液中副產(chǎn)物氨基酸和有機(jī)酸含量Table 4 The concentration of amino acid and organic acid in fermentation of recombinant and original bacteria

而重組菌較低的菌體量對(duì)發(fā)酵過程中各種氨基酸副產(chǎn)物的積累也有一定程度的削弱。發(fā)酵液中的有機(jī)酸測定結(jié)果表明，發(fā)酵液中的丙酮酸和乳酸含量與出發(fā)菌相比分別增高了41.55%、15.73%，是由于阻斷了胞內(nèi)NADPH合成途徑后，極大削弱了菌株內(nèi)以NADPH為輔酶的氨基酸合成，如以丙酮酸為前體，合成的丙氨酸族氨基酸，和經(jīng)過丙酮酸流向三羧酸循環(huán)后以草酰乙酸為前體合成的天冬氨酸族氨基酸，使得丙酮酸等代謝途徑上游的中間產(chǎn)物得以累積。

3 結(jié)論

該研究中對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)生菌C.glutamicumLYS進(jìn)行基因工程改造，構(gòu)建了重組自殺型質(zhì)粒pK18mobsacB-Δzwf、pK18mobsacB-ΔmalE用于敲除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf和蘋果酸酶編碼基因malE，克隆來源于Streptococcusmutans的NADP+-依賴型異檸檬酸脫氫酶(編碼基因icdCg)通過重組自殺型質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔicdCg::icdSm替換谷氨酸棒桿菌NAD+-依賴型異檸檬酸脫氫酶(編碼基因icdSm)，依次將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumLYS，篩選并獲得完成二次同源重組的菌株C.glutamicumLYSΔzwfΔmalEΔicdCg::icdSm，該重組菌阻斷了谷氨酸棒桿菌中NADPH合成的相關(guān)途徑。由于異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中將檸檬酸催化生成異檸檬酸，通過基因置換以改變其輔因子依賴型，本研究中用來源于Streptococcusmutans的異檸檬酸脫氫酶替換谷氨酸棒桿菌原有的異檸檬酸脫氫酶。對(duì)出發(fā)菌和重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩種不同的輔因子NADPH水平下胞內(nèi)氧化還原輔因子(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)和能量輔因子(ATP、ADP和AMP)進(jìn)行分析和比較，NADPH含量較出發(fā)菌降低了89.51%，NADPH/NADP+降低了93.13%，NADH含量提高了38.58%，NADH/NAD+提高了53.84%，ATP含量降低了13.1%。重組菌的葡萄糖代謝能力明顯弱于出發(fā)菌株，菌體的生長也相對(duì)緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間延長，最終菌體量與出發(fā)菌相比降低了4.36%。L-賴氨酸產(chǎn)量降低了87.69%， 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸合成量也都明顯降低，而在胞內(nèi)積累了大量副產(chǎn)物，如丙酮酸、乳酸等。當(dāng)阻斷胞內(nèi)NADPH的合成途徑時(shí)，胞內(nèi)微環(huán)境如氧化還原水平等受到擾動(dòng)，此時(shí)菌體生長受到影響，而對(duì)L-賴氨酸產(chǎn)量的改變尤為明顯。為進(jìn)一步解析輔因子NADPH調(diào)控L-賴氨酸產(chǎn)生菌胞內(nèi)微環(huán)境的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。