木棉花超氧化物歧化酶分離工藝的研究

張小雪，李青容，劉敏宜，周曉思，李鈺怡，謝麗玲

（汕頭大學(xué)生物系，廣東 汕頭 515063）

超氧化物歧化酶（簡稱SOD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的酸性金屬酶，在pH 5.3 ～9.5 的范圍內(nèi)可穩(wěn)定存在，對pH 不敏感，熱穩(wěn)定性較高，一般在70 ℃以上才會失活[1].根據(jù)現(xiàn)有的研究SOD 共有5 種類型，分別為Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD，Ni-SOD，Co-SOD.植物中以前三種存在形式的可能性較大，而對于后兩種目前的研究還較為缺乏，只在少數(shù)的生物中發(fā)現(xiàn)[2].SOD 能夠催化超氧陰離子，發(fā)生歧化反應(yīng)，消除其毒性，在很多方面得到廣泛的應(yīng)用.如在化妝品行業(yè)，可作為添加劑被皮膚所吸收，具有防止皮膚衰老，抑制老年斑等作用；在臨床應(yīng)用方面，SOD 具有增加機體免疫力，治療腫瘤和自身免疫癥，抑制食物過敏的療效；在農(nóng)業(yè)上，適量的SOD 能夠提高作物的抗逆能力[1，3-4].SOD 的來源廣泛，人們可以從各種材料中進(jìn)行提取，常見的包括動物血、獼猴桃、大蒜等.動物血中提取出來的SOD 可能含有致熱因子，易感染病毒和其他難清潔的污染物，對人體的免疫機制和后續(xù)的分離提純造成一定的影響，因此以動物血為原料生產(chǎn)的SOD 受到了很多國家和地區(qū)的抵制[2，5-7].目前利用微生物發(fā)酵進(jìn)行SOD 的工業(yè)化生產(chǎn)也是研究的熱點，但需要花費大量的時間在菌種的培養(yǎng)和優(yōu)化上，成本較高[8].而以植物為原料進(jìn)行提取同樣也面臨著活性較低，原料種類較少的問題[8-9].本研究則通過木棉花這種新型的原料提取SOD，具有成本低，材料來源豐富，安全性高的特點，是理想的生產(chǎn)原料，生產(chǎn)SOD 的工藝將具有廣泛的市場價值.

1 材料，儀器與試劑

1.1 材料

采集新鮮的木棉花花瓣，清洗，恒溫烘箱60 ℃烘干，制成粉末，200 目過篩，保存?zhèn)溆?

1.2 儀器與設(shè)備

FW177 型中草藥粉碎機；THZ-D 型恒溫烘箱；HD-1 型核酸蛋白檢測儀；LGJ-10型真空冷凍干燥儀；pHS-3C 型pH 計；JY92I 型超聲波細(xì)胞粉碎機；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋；UV-2100 型紫外可見分光光度計；TDL-5-A 型低速大容量離心機；BS224S 型電子天平；HL-2 型恒流泵等.

1.3 試劑

磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，濃鹽酸，氯仿，無水乙醇，丙酮，質(zhì)量濃度為85%磷酸；Tris；EDTA-2Na；考馬斯亮藍(lán)G-250；牛血清蛋白等.

1.4 試劑的配制

（1）0.05 mol/L，pH7.8 的磷酸鹽緩沖液.

（2）氯仿- 乙醇（體積比3:5）混合液.

（3）鄰苯三酚法檢測SOD 酶活性所需的試劑：

A 液：pH 8.2，0.1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖溶液.稱取1.211 4 g Tris 和37.2 mg EDTA-2Na 溶于64.2 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100 mL；

B 液：4.5 mmol/L 鄰苯三酚鹽酸溶液.稱取鄰苯三酚56.7 mg 溶于少量10 mmol/L 鹽酸溶液，并定容至100 mL.

（4）考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白含量所需的試劑：

1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液；

考馬斯亮藍(lán)G-250（0.01%）染液.

2 實驗方法

2.1 提取工藝

木棉花SOD 的提取工藝如圖1 所示.

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對木棉花SOD 酶活力的影響

稱取木棉花粉末0.34 g，在超聲波功率360 w，超聲波處理總時間8 min①利用超聲波處理的其他參數(shù)設(shè)置均為：超聲處理時間3s，間隔時間3s，浸提時間9 h 的條件下，探究不同料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 g/mL 對木棉花SOD 酶活力的影響.

圖1 木棉花SOD 提取純化工藝流程圖

2.2.2 超聲波功率對木棉花SOD 酶活力的影響

稱取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超聲波處理總時間8 min，浸提時間9 h 的條件下，探究不同超聲波功率180，270，360，450 w對木棉花SOD 酶活力的影響.

2.2.3 超聲波處理時間對木棉花SOD 酶活力的影響

稱取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超聲波功率360 w，浸提時間8 h 的條件下，探究不同超聲波處理時間4，8，12，16，20 min 對木棉花SOD 酶活力的影響.

2.2.4 浸提時間對木棉花SOD 酶活力的影響

稱取木棉花粉末0.34 g，在料液比1∶60 g/mL，超聲波功率360 w，超聲波處理總時間8 min 的條件下，探究不同浸提時間4，6，8，10 h 對木棉花SOD 酶活力的影響.

2.2.5 正交實驗

根據(jù)單因素獲得的結(jié)果，選取適當(dāng)?shù)囊蛩厮剑瑢Τ暡ㄌ崛∧久藁⊿OD 的條件進(jìn)行正交實驗優(yōu)化.

2.3 提取液的分離純化

2.3.1 熱變性法

將提取液置于水浴鍋中，60 ℃恒溫水浴15 min，加熱過程輕輕攪拌.水浴后于4 ℃冰浴30 min，之后設(shè)置4 000 r/min、15 min 的參數(shù)進(jìn)行離心、取上清，保存?zhèn)溆肹2].

2.3.2 氯仿- 乙醇法

向提取液中加入0.25 倍體積的氯仿- 乙醇（3:5）混合液，攪拌15 min 后，離心（4 000 r/min，15 min），靜置分層，取上清，保存?zhèn)溆?

2.3.3 分級沉淀法

（1）直接丙酮沉淀

向提取液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15 min 后，離心（4 000 r/min，15 min），取沉淀，-20 ℃下放置30 min；取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液，獲得粗酶液備用.

（2）丙酮二次沉淀

向提取液中加入0.6 倍的預(yù)冷丙酮，離心（4 000 r/min，15 min），留上清備用；取沉淀，-20 ℃下放置30 min，取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液，此為丙酮一次沉淀后的粗酶液.另外向上述提取的上清中加入1.2 倍的冷丙酮，進(jìn)行同樣的操作步驟，離心，取沉淀，冷凍，加磷酸緩沖液后得丙酮二次沉淀的粗酶液[10].由此可得一次沉淀和二次沉淀后的粗酶液，保存?zhèn)溆?

（3）丙酮等電點沉淀

將提取液用HCl 調(diào)節(jié)pH 至5.0，加入等體積的丙酮，攪拌均勻，離心（4 000 r/min，15 min），取上清；再調(diào)節(jié)pH 至4.0，設(shè)置同樣的參數(shù)進(jìn)行離心，獲得SOD 沉淀，-20 ℃下放置30 min；取出后溶于3 mL 0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液[7]，獲得粗酶液備用.

2.4 葡聚糖凝膠柱層析

2.4.1 Sephadex G-75 的預(yù)處理

在室溫下，將葡聚糖凝膠干粉浸泡于蒸餾水中24 h，并不斷攪拌，以保證凝膠溶脹.

2.4.2 操作步驟

將處理好的Sephadex G-75 濕法裝柱，柱床體積42 mL，利用0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液進(jìn)行平衡，待核酸蛋白質(zhì)紫外檢測儀繪出穩(wěn)定的基線即可上樣，控制流速為0.5 mL/min，用同樣的緩沖液進(jìn)行洗脫，檢測儀上每繪制一個峰便收取一管樣液，盡可能地將SOD 純化.

2.5 SOD酶活力及蛋白含量的測定

2.5.1 酶活力的測定采用微量鄰苯三酚自氧化法[11]和試劑盒法

2.5.2 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[1]

（1）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測定結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示.

（2）樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

吸取1 mL 的樣品，加入5 mL 的考馬斯亮藍(lán)G-250，混合均勻，靜置30 min 后測定其吸光值.

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 料液比對木棉花SOD 酶活力的影響

結(jié)果表明，料液比小于1∶20 g/mL 時，提取液濃稠，無法進(jìn)行后續(xù)實驗，因此選擇料液比為1∶20 g/mL 及其以上的條件進(jìn)行實驗.根據(jù)結(jié)果顯示，料液比為1∶20 g/mL時木棉花SOD 酶活力最強.隨著料液比的增大，木棉花SOD 在強離子的條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致活性逐漸降低[7]，而且料液比過高導(dǎo)致比活力變低，對后續(xù)的分離純化不利[10].因此可選擇1∶20，1∶25，1∶30 g/mL 的料液比進(jìn)行正交實驗.

圖3 料液比對木棉花SOD 活性的影響

3.1.2 超聲波功率對木棉花SOD 酶活力的影響

結(jié)果如圖4 所示，提取效果較好的超聲波功率范圍在180～270 w 左右.隨著超聲波的空化作用的增強，細(xì)胞被破壞，大量細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放，有利于木棉花SOD 的溶出；而另一方面，超聲波功率過大，對SOD 酶結(jié)構(gòu)造成破壞，降低酶活力[7].

3.1.3 超聲波處理時間對木棉花SOD 酶活力的影響

不同超聲波處理時間的實驗結(jié)果如圖5 所示，在處理總時間8 min 之前，隨著處理時間的延長，SOD 總活性逐漸提高，這是因為隨著細(xì)胞破碎越徹底，更有利于SOD 的溶出[7].在8 min 之后，隨著時間的延長，木棉花SOD 酶活力無明顯變化，說明木棉花SOD 在8 min 時已經(jīng)充分釋放.最終選擇7 min，8 min，9 min 三個水平做進(jìn)一步的正交實驗.

圖4 超聲波功率對木棉花SOD 活性的影響

圖5 超聲時間對木棉花SOD 活性的影響

3.1.4 浸提時間對木棉花SOD 酶活力的影響

結(jié)果如圖6 所示，不同浸提時間對實驗結(jié)果的影響.在浸提時間6 h 之前，隨著浸提時間的延長，SOD 總活性逐漸提高，SOD 溶出越充分；在6 h～8 h 之間，溶液中SOD的總活性保持不變；在8 h 之后，隨著時間的延長，SOD 活性逐漸下降.因此選擇6，7，8 h 三個水平做進(jìn)一步的正交實驗.

圖6 浸提時間對木棉花SOD 活性的影響

3.2 正交實驗

3.2.1 正交實驗的因素水平

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（43）的正交實驗.具體的設(shè)計情況如表1 所示.

表1 正交實驗設(shè)計

3.2.1 正交實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，對超聲波提取的條件進(jìn)行正交實驗，其結(jié)果如表2 所示.根據(jù)極差大小的比較可知，對于超聲波提取木棉花SOD 影響因素從大到小依次是：浸提時間＞超聲功率＞超聲時間＞料液比.而根據(jù)表中均值大小可得出超聲波提取木棉花SOD 的最佳條件為A3B1C3D3，從方差分析（表3）的結(jié)果可知，由于各因素對木棉花SOD總活性的影響都不顯著，不必再進(jìn)行各因素之間的多重比較.因此，料液比為1∶30，超聲波功率為180 w，超聲時間9 min，浸提時間8 h 的超聲波提取效果最理想.

表2 正交實驗的極差分析結(jié)果

表3 F檢驗分析結(jié)果

3.3 兩種提純方法結(jié)合的探究

超聲波提取木棉花SOD 后，為了盡可能地除去雜蛋白獲得純化的SOD，目前大多采用兩種方法進(jìn)行純化，例如通過熱變性結(jié)合丙酮沉淀法，或氯仿- 乙醇法結(jié)合丙酮沉淀法[1-2，12].由于本研究材料為木棉花其蛋白質(zhì)含量少，通過二種不同的方法處理之后，雖然除去了一定量的雜蛋白，但是SOD 的活性損失更大，導(dǎo)致最終純化倍數(shù)小于1，因此兩種提純方法結(jié)合，不適合用于木棉花SOD 的純化，結(jié)果如表4.

表4 兩種提純方法結(jié)合的結(jié)果

3.4 SOD提純方法的篩選

根據(jù)實驗材料的情況，探究出針對該材料最合適的純化條件.本研究結(jié)果如表5，表明利用熱變性，氯仿-乙醇，丙酮沉淀三種方法均能夠有效地純化SOD，去除一定量的雜蛋白.熱變性法相較于其他兩種方法而言，酶活性回收率高，但是處理過后的粗酶液中仍然含有較多的雜蛋白.氯仿-乙醇法進(jìn)行提純，因氯仿毒性強，后續(xù)還需要透析處理，步驟較為繁瑣[2].而丙酮沉淀法蛋白去除率高，其毒性也較小，是較為理想的提純方法.因此，在后續(xù)提純SOD 時采用丙酮沉淀法并進(jìn)行條件優(yōu)化.

表5 SOD提純方法的處理結(jié)果

3.5 丙酮沉淀條件的優(yōu)化

丙酮沉淀法對SOD 進(jìn)行純化.首先優(yōu)化純化條件，選擇合適的處理方法如表6.由于丙酮是有機溶劑，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，處理時間一般為15 min.根據(jù)表6 表明（三種沉淀方法的實驗操作見2.3.3），丙酮等電點沉淀的結(jié)果最優(yōu)，純化倍數(shù)達(dá)5.79，所以采用丙酮等電點沉淀進(jìn)行純化是最合適的方案.

表6 丙酮沉淀條件優(yōu)化的結(jié)果

3.6 確定最佳純化條件

經(jīng)上述探究，確定木棉花SOD 的提取純化方案為：超聲波處理，丙酮等電點沉淀除去雜蛋白，經(jīng)SephadexG-75（洗脫曲線如圖7 所示）進(jìn)行純化后，真空冷凍干燥獲得成品，結(jié)果如表7 所示，純化倍數(shù)可達(dá)18.46，因此該工藝流程能夠有效地將木棉花SOD 提純出來.

表7 最終提純方案的結(jié)果

圖7 葡聚糖凝膠層析的洗脫曲線

4 總結(jié)和展望

SOD 通過清除自由基在食品，化妝品，農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用，市場前景廣闊，但能從植物中提取SOD 的原材料較少，主要包括紫草，綠豆，大蒜等.有關(guān)木棉花SOD 提取工藝的研究報道極少，因此本項目利用木棉花為原料能夠為植物SOD 的提取開拓新途徑[13].根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo)，木棉花SOD 的活性較高，是較為理想的提取原料[14].本項目通過正交實驗確定超聲波提取木棉花SOD 的最佳條件為料液比1∶30 g/mL，功率180 w，總處理時間9 min，浸提時間8 h.在提純SOD 方面，目前采用的方法主要有：熱變性法，氯仿-乙醇法，丙酮分級沉淀法.根據(jù)實驗結(jié)果可知，在具體提純過程中，需要根據(jù)實驗材料的情況，選擇合適的純化方法，或者將這幾種方法有效地結(jié)合起來，探究出針對該材料最合適的純化條件.目前大多數(shù)的研究是通過二種方法結(jié)合起來充分除去雜蛋白[2，15]，而對于蛋白質(zhì)含量較少的植物樣品，如本研究的木棉花花瓣，選用丙酮等電點沉淀進(jìn)行除雜，純化效果好，提取條件溫和，適用于大規(guī)模生產(chǎn).本研究致力于開發(fā)利用廉價材料生產(chǎn)SOD，提純條件的優(yōu)化將對進(jìn)一步規(guī)模生產(chǎn)木棉花SOD提供理論依據(jù).