膠體金免疫層析法快速測(cè)定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留

周萍 李櫻紅 尹志紅 呂澤田 尹君 王靜 徐初

（1 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；2 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310052；3 中國(guó)蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)，北京 100050）

蜂膠是工蜂采集膠源植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)[1]。蜜蜂主要用蜂膠堵塞蜂巢縫隙，以防止有害細(xì)菌、病毒或真菌的入侵，保證蜂箱潔凈衛(wèi)生。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種活性物質(zhì)，其功效成分主要為黃酮類、酸類、酯類化合物等[2]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2015年版一部）載明蜂膠補(bǔ)虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌；用于體虛早衰，高脂血癥，消渴；外治皮膚皸裂，燒燙傷[3]。蜂膠憑借獨(dú)特的醫(yī)療保健作用，正越來越受到消費(fèi)者的青睞。蜂膠的活性成分和安全性已成為研究熱點(diǎn)。

氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，是預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾?。乐抻紫x腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等）的有效藥物。然而，氯霉素易在蜂產(chǎn)品中殘留，人們食用后會(huì)引起粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血等[4]，美國(guó)、日本等許多國(guó)家和歐盟都禁止氯霉素在動(dòng)物源性食品中檢出。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第193號(hào)公告中明確指出，氯霉素禁用于所有食品動(dòng)物。為了保證國(guó)內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)和進(jìn)出口市場(chǎng)中蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，亟須開發(fā)方便有效的檢測(cè)蜂產(chǎn)品中氯霉素殘留的方法，以提高蜂產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前關(guān)于蜂蜜和蜂王漿中氯霉素檢測(cè)方法的報(bào)道比較多，主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-8]、氣相色譜 - 質(zhì)譜法[9，10]、酶聯(lián)免疫法[11，12]等。然而，目前，尚無蜂膠中氯霉素殘留量檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，已報(bào)道的蜂膠中氯霉素檢測(cè)方法主要集中在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。其中，周萍等[14]首次報(bào)道了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蜂膠中的氯霉素殘留，為蜂膠企業(yè)提供了氯霉素的內(nèi)控檢測(cè)方法，楊黎等[15]報(bào)道了以蜂膠為主要原料的保健食品中氯霉素殘留的檢測(cè)方法，為蜂膠制品中氯霉素殘留分析提供了思路。然而，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)儀器要求較高，短時(shí)間內(nèi)無法在蜂產(chǎn)品企業(yè)中普及應(yīng)用，而膠體金免疫層析法[16-18]具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，也不需要復(fù)雜的儀器，能在短短幾小時(shí)內(nèi)檢測(cè)幾十到幾百個(gè)樣品，可適用于大規(guī)模快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控產(chǎn)品中藥物殘留。

由于蜂膠的成分與蜂蜜、蜂王漿有很大差別，基質(zhì)更加復(fù)雜，本文通過合適的前處理手段，首次建立了膠體金免疫層析法快速測(cè)定蜂膠及蜂膠乙醇提取物中氯霉素殘留的檢測(cè)方法，可指導(dǎo)蜂農(nóng)對(duì)生產(chǎn)的蜂膠原料進(jìn)行質(zhì)量控制，為蜂膠收購(gòu)者提供蜂膠原料或者蜂膠提取物中氯霉素殘留量的快速監(jiān)測(cè)與篩查，從而保證蜂膠源頭的品質(zhì)，進(jìn)而保證蜂膠制品的品質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Sartorius BS224S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），Philips HR2100/40攪拌機(jī)（飛利浦（中國(guó)）投資有限公司），Philips HP8260電吹風(fēng)機(jī)（飛利浦（中國(guó)）投資有限公司）。

氯霉素（chloramphenicol，CAS：56-75-7，純度＞99.9%）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司），氫氧化鈉、高氯酸、氯化鈉、乙酸乙酯、正己烷等均為分析純，水為娃哈哈純凈水或相當(dāng)者，CAP-203氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板購(gòu)自杭州南開日新生物技術(shù)公司。

蜂膠和蜂膠乙醇提取物由中國(guó)蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用乙腈定容至10ml，混勻，于-18℃冰箱保存，可保存24個(gè)月。

1.2.2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液

吸取適量1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成濃度為0.1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4℃冰箱保存，可保存6個(gè)月。

1.2.3 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液

臨用時(shí)吸取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液100μl，用娃哈哈純凈水稀釋定容至10ml，混勻，即得濃度為1μg/l的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 樣品制備

取蜂膠原料適量于攪拌機(jī)塑料杯中，粉碎30s，取下塑料杯，混合一次繼續(xù)粉碎30s，如此3～5次，取砂粒狀較細(xì)的物料用于檢測(cè)。當(dāng)膠含量大于30%時(shí)，需要冷藏2h再進(jìn)行粉碎。

1.4 樣品處理

向50ml塑料離心管中加入8ml蜂膠溶解液A（5%氫氧化鈉溶液）和8ml水，混合均勻，稱入蜂膠原料4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），擰緊瓶蓋，在掌心上輕輕拍打5min，使蜂膠溶解，加入蜂膠沉淀劑B（20%高氯酸溶液），用力震搖1min，過濾，收集全部濾液。加入0.25ml堿化劑C（80%氫氧化鈉溶液），混合均勻，加入16ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干。加入4ml 1mol/l氯化鈉水溶液（含5%（V/V）乙醇）使溶解，加4ml乙酸乙酯，充分振蕩1min，靜置2～5min，吸取上層清液于蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干，加入5滴復(fù)溶液（氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板自帶）反復(fù)吹吸蒸發(fā)皿上的殘?jiān)?，直到全部溶解。加?ml正己烷，反復(fù)吹吸樣液和正己烷，靜置分層2min，樣液層待測(cè)定。

1.5 測(cè)定

1.5.1 具體操作

取出氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板，置于水平臺(tái)面上，直至恢復(fù)至室溫。吸取“1.4”中蒸發(fā)皿里的全部樣液層，加至加樣孔中，在10min后目測(cè)讀取結(jié)果。

1.5.2 空白對(duì)照

每批樣品需做一孔空白對(duì)照，以復(fù)溶液代替試樣提取液，按“1.5.1”進(jìn)行。

1.5.3 平行測(cè)定

設(shè)定每個(gè)樣品的平行樣數(shù)量≥2，各自按“1.4”和“1.5.1”進(jìn)行。

1.5.4 檢測(cè)限試驗(yàn)

稱取陰性蜂膠原料樣品4g（或蜂膠乙醇提取物稱取3g），加入1μg/l的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液400μl（蜂膠乙醇提取物樣品則加600μl），相當(dāng)于添加量水平蜂膠原料為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物為 0.2μg/kg。

注：不同試劑板制造商的產(chǎn)品組成和操作會(huì)有細(xì)微的差別，應(yīng)嚴(yán)格按說明書要求規(guī)范操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品凈化方法優(yōu)化

蜂膠溶解液A用于溶解蜂膠中氯霉素和其他水溶性活性物質(zhì)，蜂膠沉淀劑B用于沉淀蜂膠中的樹脂類、蜂蠟等雜質(zhì)。過濾時(shí)，蜂膠原料樣品和蜂膠提取物樣品的過濾時(shí)間因樣品不同略有差異。由于不同來源的蜂膠樣品差異較大，過濾后的樣品或澄清或不澄清，這是因?yàn)榉淠z原料中存在某些蛋白質(zhì)、膠體、雜質(zhì)，不影響后續(xù)操作。

濾液中加入堿化劑后，其有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、膠體、酚類、黃酮類化合物形成鹽類，此時(shí)加入乙酸乙酯振蕩，可充分提取氯霉素。由于乙酸乙酯微溶于水，振蕩時(shí)可能使樣液乳化，影響分層效果。經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)，加入16ml乙酸乙酯可充分保證提取和分層效果，故乙酸乙酯添加量確定為16ml。在靜置時(shí)管壁可能粘附有樣液，吸取乙酸乙酯層時(shí)易被誤吸入，此時(shí)，可以用手輕敲管壁，管壁振動(dòng)使樣液自然落下，再靜置幾分鐘即可吸取乙酸乙酯層。

將乙酸乙酯提取液置于90cm蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)機(jī)吹干。一般膠體金快速檢測(cè)方法推薦的乙酸乙酯層吹干方法是將液體置于窄口的離心管中，由于管口較窄，不利于熱風(fēng)進(jìn)入，也不利于乙酸乙酯揮發(fā)，比較耗時(shí)。本方法將乙酸乙酯層置于敞口的蒸發(fā)皿中，方便吹干，實(shí)踐表明吹干時(shí)間平均為6min，速度非?？?。

蒸發(fā)皿中的殘?jiān)恍璧渭?.16ml氯霉素復(fù)溶液就可以溶解，具體操作時(shí)用1ml滴管滴加5滴氯霉素復(fù)溶液，先沖洗浸潤(rùn)然后用滴管反復(fù)吹吸殘留物，浸潤(rùn)過的殘留物很容易被溶解在復(fù)溶液中。最后，將滴管頭部浸在復(fù)溶液中，復(fù)溶液會(huì)全部虹吸到滴管中，全部滴加到氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的加樣孔中即可檢測(cè)。

為了降低方法的檢測(cè)限，本方法增加了鹽析凈化過程，大幅度降低了雜質(zhì)水平，減少干擾，從而降低了本方法的檢測(cè)限。

2.2 結(jié)果及表述

結(jié)果判讀見圖1。

無效：如空白對(duì)照控制線（C線）不出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測(cè)試劑板失效或操作不當(dāng)，為無效結(jié)果，不能進(jìn)行檢測(cè)。

陰性：試樣檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)紅色條帶，且顏色比控制線（C線）深或一樣深，結(jié)果為陰性（蜂膠原料氯霉素殘留量＜0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物＜0.2μg/kg）。

圖1 結(jié)果示意圖

陽(yáng)性：試樣檢測(cè)線（T線）出現(xiàn)紅色條帶，但顏色比控制線（C線）淺或檢測(cè)線（T線）未出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性（蜂膠原料氯霉素殘留量≥0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物≥0.2μg/kg）。

2.3 檢測(cè)限與回收率

分別取0.3μg/l、1μg/l濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液5滴點(diǎn)到試劑板樣品孔中，5min后目測(cè)，0.3μg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液的C線比T線的顏色淺，1μg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液的C線比T線的顏色明顯更深，所以，試劑板檢測(cè)氯霉素的靈敏度是1μg/l。

取陰性蜂膠原料樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗(yàn)，0.1μg/kg、0.2μg/kg添加時(shí)均可得到陽(yáng)性結(jié)果。取陰性蜂膠乙醇提取物樣品，分別加入0.1μg/kg和0.2μg/kg添加水平的氯霉素，按本方法檢驗(yàn)，0.1μg/kg的C線比T線的顏色不能更深，0.2μg/kg添加時(shí)可得到陽(yáng)性結(jié)果。由此可見，本方法蜂膠原料檢測(cè)限為0.1μg/kg，蜂膠乙醇提取物檢測(cè)限為0.2μg/kg。

按蜂膠原料中乙醇提取物含量為30%計(jì)，在本方法檢測(cè)限以下的蜂膠原料，加工成提取物時(shí)，氯霉素殘留最高值0.3μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為30%時(shí)，可滿足限量0.1μg/kg的要求。蜂膠乙醇提取物檢測(cè)限為0.2μg/kg，蜂膠制品中的蜂膠乙醇提取物含量為50%時(shí)，可滿足限量0.1μg/kg的要求。

2.4 與質(zhì)譜結(jié)果的一致性驗(yàn)證

取28份蜂膠樣品，分別采用本文的膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表中可見，膠體金免疫層析法的結(jié)果與液質(zhì)確證結(jié)果一致，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0%，說明方法準(zhǔn)確可行。

從數(shù)據(jù)上看，采用本文的膠體金免疫層析法檢測(cè)到8個(gè)陰性樣品，說明均在檢測(cè)限以下，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果均為＜0.1μg/kg，假陰性率均為0%。采用本文的膠體金免疫層析法檢測(cè)到20個(gè)陽(yáng)性樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素為0.11～22.9μg/kg，假陽(yáng)性率均為0%。其中有3個(gè)樣品T線、C線同時(shí)顯色，且C線顏色稍深，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素為0.11～0.13μg/kg，證實(shí)氯霉素殘留處于較低水平，稍高于檢測(cè)限而呈弱陽(yáng)性。其余膠體金免疫層析法檢測(cè)為陽(yáng)性的17個(gè)樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)到的氯霉素為0.34～22.9μg/kg，其中0.34μg/kg～0.53μg/kg的樣品T線、C線同時(shí)顯色，且C線顏色明顯較深，而0.67μg/kg的樣品T線幾乎不顯色了。綜上所述，膠體金免疫層析法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)氯霉素結(jié)果完全一致，未出現(xiàn)假陰性與假陽(yáng)性的情形。

此外，本方法已經(jīng)經(jīng)過杭州天廚蜜源保健品有限公司驗(yàn)證，驗(yàn)證樣品的檢測(cè)結(jié)果與方法開發(fā)者一致。

表1 膠體金免疫層析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法氯霉素結(jié)果判定表

2.5 檢測(cè)時(shí)間

按本方法檢測(cè)，單個(gè)樣品用時(shí)約30min，同時(shí)檢測(cè)6個(gè)樣品，需時(shí)2.5h，平均每個(gè)樣品需時(shí)25min。

3 結(jié)論

（1）本文首次采用膠體金免疫分析方法對(duì)蜂膠及其乙醇提取物中的氯霉素殘留量進(jìn)行了研究。樣品在堿性條件下溶解稀釋，20%高氯酸溶液除雜過濾后，加入堿化劑適量，經(jīng)乙酸乙酯提取，鹽析凈化后，再用乙酸乙酯提取吹干，加入正己烷和復(fù)溶液溶解后，用膠體金快速檢測(cè)試劑板快速檢測(cè)。結(jié)果表明，膠體金免疫層析法對(duì)蜂膠及蜂膠提取物中氯霉素殘留量的檢測(cè)限分別為0.1μg/kg和0.2μg/kg。經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0%。本方法操作簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，是蜂膠源頭收購(gòu)中監(jiān)控蜂膠中氯霉素殘留量的有效實(shí)用的方法。

（2）按本文建立的方法對(duì)中國(guó)蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂膠專業(yè)委員會(huì)的28份蜂膠樣品進(jìn)行氯霉素殘留量測(cè)定，陰性率僅為28.6%，從結(jié)果看，蜂膠中氯霉素殘留量情況不容樂觀。蜂膠已經(jīng)被公認(rèn)為是良好的保健食品原料和中藥，需要業(yè)內(nèi)人士借助本檢測(cè)方法的應(yīng)用努力解決此安全問題。

（3）氯霉素是動(dòng)物禁用藥物，在蜂產(chǎn)品行業(yè)，自2001年以來，氯霉素問題通過業(yè)內(nèi)人士的共同努力，在蜂王漿、蜂蜜等蜂產(chǎn)品原料中已經(jīng)基本檢測(cè)不到氯霉素了。蜂膠屬于脂溶性物質(zhì)，與氯霉素有高度的相溶性，由于蜂膠長(zhǎng)期粘附在巢框、箱蓋中，每次取膠時(shí)不能全部從上面取凈，導(dǎo)致下次取膠時(shí)不同程度留有上次的蜂膠。2010年，周萍等[14]檢測(cè)到的蜂膠原料中氯霉素殘留量遠(yuǎn)高于本次28個(gè)樣品，側(cè)面說明我國(guó)蜂膠原料中的氯霉素殘留量正在逐年減少。

（4）為了解決蜂膠中的氯霉素問題，本文做如下建議：如果蜂群所取蜂膠氯霉素陽(yáng)性，建議全新更換蜂箱、巢框；蜂農(nóng)用藥時(shí)，對(duì)蜂藥中的禁用藥物進(jìn)行檢測(cè)，堅(jiān)決不用含有禁用藥物的蜂藥；對(duì)周邊環(huán)境、水源進(jìn)行調(diào)查，必要時(shí)可以取水樣檢測(cè)氯霉素殘留量。