蜂產(chǎn)品中新煙堿類農(nóng)藥檢測前處理方法研究進展

伍思源 陳文彬 涂熹娟 繆曉青,

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全決定了養(yǎng)蜂業(yè)的經(jīng)濟效益，農(nóng)獸藥殘留是引起蜂產(chǎn)品質(zhì)量下降的重要因素之一，然而蜂產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜，需要經(jīng)過提取、凈化、濃集等一系列步驟才能用于儀器檢測。因此，需要開發(fā)簡單、快速、有效、穩(wěn)定的前處理方法用于蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的檢測。

新煙堿類農(nóng)藥是一種相對較新的類尼古丁農(nóng)藥，作用于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體，是世界上應(yīng)用最廣泛的農(nóng)藥之一。過量使用新煙堿類農(nóng)藥可能直接污染蜂產(chǎn)品，也可能通過污染環(huán)境如土壤、水源、蜜粉源植物等間接污染蜂產(chǎn)品。目前，檢測蜂產(chǎn)品中新煙堿類農(nóng)藥的前處理方法主要有固相萃?。⊿PE）、液液萃?。↙LE）、QuEChERS等。

1 蜂蜜

蜂蜜有豐富的營養(yǎng)成分，含有大量的糖類物質(zhì)，此外還包括微量元素和生物活性物質(zhì)，如酚類化合物、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機酸、游離氨基酸、酶和維生素等[1]，這也使得蜂蜜基質(zhì)比較復(fù)雜。蜂蜜中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)于表1中。

Fidente P[2]等人將SPE應(yīng)用于蜂蜜中新煙堿類農(nóng)藥的檢測。該研究將蜂蜜溶于純水中，然后轉(zhuǎn)移到含硅藻土的SPE柱中，用二氯甲烷洗脫SPE柱。通過LC-ESI-MS分析了4種新煙堿類農(nóng)藥。

Song SM[3]等人使用一次性移液器提取法（DPX）測定了蜂蜜中的8種新煙堿類農(nóng)藥。該文獻研究了2種離子交換劑（QAE Sephadex A-25和SP Sephadex C-25），發(fā)現(xiàn)QAE Sephadex A-25陰離子交換劑效果更好。此外，還對比了陰離子交換劑-DPX法和QuEChERS法，結(jié)果顯示離子交換劑-DPX法不但回收率更高，而且可以凈化糖、水溶性色素、無機鹽等物質(zhì)，從而降低基質(zhì)效應(yīng)甚至可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)。

Jovanov P[4]等人將分散液液微萃?。―LLME）用于蜂蜜樣品前處理方法，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了蜂蜜樣品中的7種新煙堿類農(nóng)藥。該研究將乙腈作為分散劑，二氯甲烷作為提取劑處理蜂蜜樣品。然后經(jīng)過渦旋、超聲、離心、干燥、復(fù)溶等步驟，通過LC-MS/MS進行檢測。

Malgorzata Gbylik-Sikorska[5]等人測定了蜂蜜樣品中多達(dá)13種目標(biāo)物。該研究將蜂蜜加入到含有水、乙腈、乙酸乙酯、三乙胺的混合溶液中，渦旋、超聲、離心后將上清液轉(zhuǎn)移到SPE柱中。用乙腈和乙酸乙酯混合物作為洗脫液洗脫兩次，該研究發(fā)現(xiàn)在提取劑中加入三乙胺-乙腈溶液可以提高回收率。

Gina Tanner[6]等人比較了兩種前處理方法（SPE和QuEChERS）測定蜂蜜中的8種新煙堿類農(nóng)藥及2種代謝物。SPE方法是將蜂蜜溶于水中，再加入甲醇，用濾紙過濾，硅藻土作為助濾劑。然后把濾液中的有機溶劑蒸發(fā)干燥，將水溶液轉(zhuǎn)移到ChemElut 1020柱上，用環(huán)己烷和乙酸乙酯混合溶液洗脫。QuEChERS方法是將蜂蜜溶于水和乙腈中，加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉，進行提取，將上清液轉(zhuǎn)移到含有無水硫酸鎂和PSA的離心管中凈化。結(jié)果顯示，SPE方法對于烯啶蟲胺和呋蟲胺的回收率較低；而采用QuEChERS方法處理蜂蜜樣品，回收率得到了顯著提高。此外，Bridi R[7]等人也用QuEChERS方法，通過LC-MS/MS分析了智利地區(qū)蜂蜜中的4種新煙堿類農(nóng)藥。

Campillo N[8]等人提出了固相萃取與分散液液微萃取（SPE-DLLME）相結(jié)合的方法測定蜂蜜中5種新煙堿類農(nóng)藥。該研究將蜂蜜溶于水中，轉(zhuǎn)移至SPE小柱，用乙腈洗脫。隨后進行DLLME步驟：將SPE的洗脫液轉(zhuǎn)移到氯化鈉水溶液中，加入CHCl3作為提取劑，離心后收集下層溶液，干燥復(fù)溶，注入LC系統(tǒng)。該研究還比較LC-DAD和LC-MS/MS的結(jié)果。

在國內(nèi)，李菊穎[9]等人用QuEChERS方法處理蜂蜜樣品，用乙腈和水作為提取劑，PSA和無水硫酸鎂作為凈化劑處理蜂蜜樣品，然后通過UPLC-MS/MS同時測定了蜂蜜中的6種新煙堿類農(nóng)藥。粟有志[10]等人用水作為提取劑加入到蜂蜜中，用PSA和酸性Al2O3凈化樣品，通過LC-MS測定了蜂蜜中的9種新煙堿類農(nóng)藥。王東[11]等人采用鹽析輔助均相液液萃取結(jié)合分散固相萃取法處理蜂蜜樣品，該研究在蜂蜜中加入水和乙腈，并且加入氯化鈉進行提取，取上清液加入無水硫酸鎂和PSA凈化。呂冰[12]等人也是在乙腈水體系中加入氯化鈉進行提取，但是用PPVP進行凈化。因為PPVP不僅能除去蜂蜜中的酚酸類物質(zhì)，而且價格比較便宜。

表1 蜂蜜中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)

2 蜂花粉

蜂花粉是蜜蜂采集時帶回的花粉團，營養(yǎng)成分包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、維生素、礦物質(zhì)、多酚和少量其他成分[13]。由于其復(fù)雜的基質(zhì)組成，加大了樣品提取、凈化的難度。蜂花粉中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)于表2中。

Olalla Ló pez-Fernández[14]等人在研磨過的蜂花粉中加入純水、乙腈、無水硫酸鎂、乙酸鈉進行提取。搖動、離心后取上清液，再次加入硫酸鎂去除水分，再離心取上清液過SupelcleanTMENVI-Carb II/PSA柱，用乙腈洗脫，將洗脫液用氮氣吹干，加水復(fù)溶，然后通過HPLC-MS/MS分析了7種新煙堿類農(nóng)藥。

Mei Chen[15]等人測定了蜂花粉中的8種新煙堿類農(nóng)藥。該研究將蜂花粉研磨成細(xì)粉，加入水、乙腈和正己烷搖勻后，加入一個QuEChERS試劑盒和一個陶瓷均質(zhì)機充分提取，用含有PSA、C18和MgSO4的d-SPE小瓶凈化。Valverde S[16]等人也采用QuEChERS方法處理蜂花粉樣品，同時測定了樣品中的7種新煙堿類農(nóng)藥。不同之處在于提取上清液后會放置在有干冰的聚苯乙烯盒中2min，以沉淀脂肪和蛋白質(zhì)。

Karen P.Yá ?ez[17]等人使用了一種十分簡單的前處理方法處理蜂花粉樣品，測定了樣品中的7種新煙堿類農(nóng)藥。該方法將二氯甲烷加入花粉中，振動混合，離心，提取上清液，用濾紙過濾，蒸發(fā)干燥，用乙腈水復(fù)溶。該方法與其他方法相比較為簡單、快速。

3 蜂王漿

蜂王漿是一種功能性食品，在營養(yǎng)學(xué)和化妝品中具有潛在價值，其主要成分是蛋白質(zhì)、碳水化合物以及脂質(zhì)[18]。蜂王漿中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)于表3中。

侯建波[19]等人采用QuEChERS方法處理蜂王漿樣品，通過LC-MS/MS測定樣品中的10種新煙堿類農(nóng)藥及2種代謝產(chǎn)物。該研究用水和甲醇提取蜂王漿中的農(nóng)藥，PSA、C18和無水MgSO4作為分散劑凈化樣品。干燥樣品后，用甲酸水-甲醇溶液復(fù)溶。

Silvia Valverde[20]等人測定了兩種不同蜂王漿產(chǎn)品（液體膳食補充劑和新鮮蜂王漿）中的7種新煙堿類農(nóng)藥。根據(jù)該研究報道，液體膳食補充劑使用SPE處理，將液體膳食補充劑用甲酸銨水溶液稀釋，采用SPE試劑盒，用甲醇和乙酸乙酯混合液洗脫。而新鮮蜂王漿則使用DLLME方法處理，將新鮮王漿用乙腈和氯仿進行提取，而且加入兩次氯仿，重復(fù)提取。對于液體膳食補充劑，他們還同QuEChERS方法進行對比，但是QuEChERS方法會形成一個界面，難以收集上清液，因此使用SPE方法。對于新鮮王漿，他們也同SPE方法和QuEChERS方法進行了對比，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPE方法會堵塞SPE柱，QuEChERS方法也會形成一個界面，所以最后選擇了DLLME方法進行前處理。

表2 蜂花粉中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)

表3 蜂王漿中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)

表4 蜂蠟中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)

4 蜂蠟

蜂蠟主要由脂肪酸、脂肪醇、鏈烷烴和游離脂肪酸的混合物組成。養(yǎng)蜂活動中使用的新煙堿類農(nóng)藥具有低揮發(fā)性和持久性[21]，而且，養(yǎng)蜂實踐中，通常會熔化舊的蜂蠟作為制造新蜂蠟的原料，所以新煙堿類農(nóng)藥在蜂蠟上可能逐漸積累。蜂蠟被污染，意味著相關(guān)的蜂產(chǎn)品也有被污染的風(fēng)險[22]。蜂蠟中新煙堿類農(nóng)藥檢測的前處理方法總結(jié)于表4中。

Karen P.Yá nez團隊于2013年發(fā)表了一篇測定蜂蠟樣品中吡蟲啉的研究[23]和一篇測定蜂蠟樣品中7種新煙堿類農(nóng)藥的研究[24]。他們使用LLE-SPE結(jié)合的方法處理蜂蠟樣品，在蜂蠟樣品中加入正己烷和異丙酮的混合溶液，然后加熱使蜂蠟熔化，再加水進行提取。將提取液轉(zhuǎn)移到SPE柱中，并加入丙酮洗脫。

Claire Jabot[25]等人將蜂蠟融于戊烷中，然后倒入含有硅藻土的離心管中，干燥離心管，加入酸化的乙腈溶液進行洗脫，將洗脫液放在-18℃下靜置15h，以沉淀雜質(zhì)。氮吹干燥后，用甲醇水復(fù)溶，通過LC-MS檢測樣品中的新煙堿類農(nóng)藥。該研究還嘗試了單一溶液和混合溶液的液液萃取，但效果不好，因此選擇了固相萃取技術(shù)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)在氮吹干燥前加入二甲基亞砜可以提高回收率。

Silvia Valverde[26]等人將甲醇和乙酸乙酯的混合物作為提取劑，用干冰冷凍沉淀雜質(zhì)，然后將上清液轉(zhuǎn)移到EMR-Lipid SPE管中凈化。該研究結(jié)果還顯示商業(yè)化的EMR-Lipid管能有效凈化蜂蠟基質(zhì)。

5 結(jié)語

檢測蜂產(chǎn)品中新煙堿類農(nóng)藥的前處理方法以液液萃取、固相萃取或兩種方法相結(jié)合為主。目前還出現(xiàn)了商品化的QuEChERS試劑盒和SPE柱，這有效減少了實驗操作時間，并且降低了實驗誤差。蜂產(chǎn)品中新煙堿類農(nóng)藥的前處理方法日趨完善，并向簡單、快速、高靈敏度、低有機溶劑消耗、低成本的方向發(fā)展。