5-氟尿嘧啶卟啉錳/鋅配合物的合成、光電性質(zhì)及抗癌活性

任麗磊 彭曉霞 王樹(shù)軍 肖立偉 李澤強(qiáng)

(廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廊坊 065000)

5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床使用的廣譜抗癌藥物，它能抑制胸苷酸合成酶，干擾DNA和RNA的合成，已成功應(yīng)用于腸癌、胃癌、乳腺癌等實(shí)體癌的治療[1]。但由于首過(guò)代謝顯著、脂溶性低、對(duì)癌細(xì)胞選擇性差，影響抗腫瘤療效。為了降低其毒副作用，科研工作者對(duì)5-FU進(jìn)行了大量的化學(xué)修飾[2-4]，結(jié)果表明，將5-FU適當(dāng)衍生化，可提高其選擇性，降低毒副作用。

另一方面，卟啉及金屬卟啉是一種重要而特殊的物質(zhì)，具有獨(dú)特的生物活性。對(duì)卟啉進(jìn)行功能分子設(shè)計(jì)、合成，在光動(dòng)力療法[5-6]及抗癌方面[7-8]備受關(guān)注，有著十分廣闊的應(yīng)用前景。利用卟啉對(duì)惡性腫瘤有特殊的親和力[7]這一特點(diǎn)，將其與抗癌藥物相連，組成卟啉-抗癌藥物的二元體系，是近年來(lái)卟啉化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，這種二元體系包括卟啉-BNCT體系，卟啉-順鉑體系，卟啉-蒽醌體系[9-11]等。研究表明，組合分子的抗癌療效遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2種藥物同時(shí)使用時(shí)的療效。

基于這些考慮，本文合成了一種新型的5-氟尿嘧啶卟啉化合物(L)及其錳配合物(MnL)、鋅配合物(ZnL)，對(duì)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，研究了它們的光、電性質(zhì)和抗癌活性。以期為篩選新的抗癌藥物提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

BRUKER AVANCE 400型核磁共振儀；Agilent 6520 QTOF LC/MS質(zhì)譜分析儀；Shimadzu-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；WGY-10型熒光分光光度計(jì)；Prestige-21傅立葉變換紅外光譜儀；CHI660C電化學(xué)工作站。

吡咯和 1，2-二溴乙烷 (使用前重蒸)，5-氟尿嘧啶(用前重結(jié)晶)，所有試劑均為市售分析純。5-鄰羥基苯基-10，15，20-三苯基卟啉(A)和 5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉(B)參照文獻(xiàn)[12]合成。

1.2 化合物的合成

目標(biāo)化合物的合成路線如Scheme1所示。

Scheme 1 Synthetic routes of the ligand and complexes

1.2.1 5-(2-(5-氟尿嘧啶-3-基)乙氧基苯基)-10，15，20-三苯基卟啉(L)的合成

在100 mL干燥的圓底燒瓶中，加入130 mg(1 mmol)5-氟 尿 嘧 啶 和 30 mL N，N-二 甲 基 甲 酰 胺(DMF)，攪拌使之溶解。加入焙燒過(guò)的無(wú)水K2CO3166 mg(1.2 mmol)，于 80 ℃攪拌 1 h，使 5-氟尿嘧啶生成鉀鹽。然后加入88 mg(0.12 mmol)5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10，15，20-三苯基卟啉，升溫至 120 ℃，攪拌，10 h后停止。飽和NaCl溶液鹽析，抽濾，蒸餾水洗滌，干燥。粗產(chǎn)品用柱色譜分離，用氯仿與丙酮體積比為4:1的混合液淋洗，收集第二色帶，旋蒸干燥，得紫色晶體L 23 mg，產(chǎn)率為22%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ-2.74(s，2H，Pyrrole N-H)，4.10～4.12(t，2H，OCH2)，4.30～4.31(t，2H，-NCH2)，7.75～7.78(m，4H，ArO-o，m，p-H),7.99(s，1H,C-H in 5-FU),8.21～8.31(m,15H,Ar-H),8.81～8.83(m,8H,Pyrrole-H)；HRMSESI(m/z):[M+H]+787.282 6，按 C50H35FN6O3計(jì)算值:787.282 7；UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):418(3.66×105)，514(1.46×104)，549(4.87×103)，589(3.41×103),644(1.95×103)；IR(KBr,cm-1):ν(NH)3 471，ν(CH)2 924，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 517，ν(COC)1 136。

1.2.2 金屬配合物MnL、ZnL的合成

在50 mL圓底燒瓶中，加入25 mg(0.032 mmol)化合物 L、20 mL二氯甲烷，再加入 63 mg(0.32 mmol)氯化錳溶于甲醇制成的飽和溶液，電磁攪拌下回流，反應(yīng)1 h。冷卻，蒸餾水洗滌，分液。有機(jī)層水浴蒸干。粗產(chǎn)品用氯仿與丙酮體積比為4∶1的混合液洗脫。收集最濃綠色帶，旋蒸濃縮，干燥得綠色固體MnL 17 mg，產(chǎn)率為63.6%。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+839.197 0,按C50H33FN6O3Mn計(jì)算值:839.197 3;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):478(1.67×105)，580(1.15×104)，622(1.03×104)；IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 412，ν(CH)2 922，ν(CO)1 637，ν(C=C)1 570,ν(COC)1 240，ν(Mn-N)1 010。

按上述方法，用59 mg(0.32 mmol)乙酸鋅代替氯化錳，得紫紅色固體ZnL 21.8 mg，產(chǎn)率為80.3%。1H NMR(CDCl3，400 MHz):δ4.12～4.13(m，2H，OCH2),4.22～4.30(m，2H，-NCH2),7.60～7.64(m，4H，ArO-o，m，p-H)，7.85(s，1H，C-H in 5-FU)，8.18～8.24(m，15H，Ar-H)，8.67～8.69(m，8H，Pyrrole-H)；HRMS-ESI(m/z):[M+H]+848.188 4,按C50H33FN6O3Zn計(jì)算值:848.188 4;UV-Vis(CHCl3):λmax/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):419(3.83×105),547(1.48×104),583(1.23×103);IR(KBr，cm-1):ν(NH)3 471,ν(CH)2 924,ν(CO)1 637,ν(C=C)1 575，ν(COC)1 261，ν(Zn-N)997。

1.3 熒光光譜的測(cè)定

以三氯甲烷為溶劑，配制濃度為10μmol·L-1的溶液進(jìn)行熒光光譜的測(cè)定。熒光光譜測(cè)試條件:室溫，樣品池為1 cm×1 cm×4 cm石英池，激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm，負(fù)高壓:450 V，掃描范圍:550～750 nm。

1.4 電化學(xué)測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)中循環(huán)伏安法實(shí)驗(yàn)條件如下:采用三電極體系，玻碳電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。以二氯甲烷為溶劑，樣品濃度為 1 mmol·L-1,支持電解質(zhì)為 0.1 mol·L-1四丁基高氯酸銨，掃描速率50 mV·s-1，測(cè)定前用高純氬氣除去體系中的氧氣，在氬氣氣氛下進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。

1.5 抗癌活性測(cè)試

胎牛血清購(gòu)自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Invitrogen公司，SRB購(gòu)自Sigma公司，酶標(biāo)儀(MD公司，M5型)。人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株Bel-7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心。

應(yīng)用磺酰羅丹明B蛋白染色法(SRB法)檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)癌細(xì)胞(A549、Bel-7402和HCT-8)增殖生長(zhǎng)的抑制作用。步驟如下:接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，37℃，5%(V/V)CO2培養(yǎng)24 h。藥物處理孔加入10μL樣品溶液 (終濃度:化合物為5 μg·mL-1；混合物為 50 μg·mL-1)，陽(yáng)性藥物孔加入終濃度為5μg·mL-1的5-FU進(jìn)行處理；對(duì)照孔加入含等體積溶媒的培養(yǎng)基，37℃，5%(V/V)CO2培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)基，輕輕加入100μL 4℃預(yù)冷的50%TCA固定細(xì)胞。先靜置5 min，然后再移至4℃放置1 h。倒掉固定液，蒸餾水洗滌5次去除TCA，空氣干燥1 h。每孔加入0.4%SRB溶液80μL，室溫染色30 min。棄染液，1%醋酸洗滌5次充分去除未結(jié)合的SRB，空氣干燥。加入150μL 10 mmol·L-1Trisbase(pH=10.5)溶解，用M5酶標(biāo)儀于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(Ri):

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜

從實(shí)驗(yàn)部分紫外數(shù)據(jù)可以看出:(1)自由卟啉的紫外可見(jiàn)光譜有1個(gè)Soret帶和4個(gè)Q帶。在418 nm處的強(qiáng)吸收是Soret帶，由電子從基態(tài)S0躍遷到最低激發(fā)單重態(tài)S2產(chǎn)生；在500～650 nm之間的吸收帶是Q帶，由電子從基態(tài)S0躍遷到最低激發(fā)單重態(tài)S1產(chǎn)生，這些是卟啉的特征光譜；(2)自由卟啉與Mn2+、Zn2+配位后，Q帶吸收峰由4個(gè)減少到2個(gè)。這是由于當(dāng)金屬離子與自由卟啉配位后，形成N-M鍵，配合物的對(duì)稱(chēng)性由D2h變?yōu)镈4h，且能級(jí)靠近，表現(xiàn)為QⅠ、QⅣ譜帶消失，同時(shí)Soret帶發(fā)生一定程度的位移。紫外光譜的明顯變化說(shuō)明金屬離子與自由卟啉配位，生成了金屬配合物[13]；(3)與鋅配合物相比，錳配合物的Soret帶紅移至478 nm。分析原因?yàn)?2種金屬離子的相對(duì)離子半徑順序?yàn)镸n2+(88 pm)＞Zn2+(74 pm)， 而電負(fù)性 Mn2+(1.5)＜Zn2+(1.6)，因此錳對(duì)外層價(jià)電子的束縛力較弱，使得電子更易流向卟啉環(huán)，從而使卟啉環(huán)上的電子云密度升高，降低電子躍遷所需要的能量，使得Soret帶紅移較多[14-15]。

2.2 紅外光譜

根據(jù)文獻(xiàn)[16]對(duì)3種化合物的紅外特征吸收光譜進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)歸屬，數(shù)據(jù)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。在自由卟啉中，1 637 cm-1處的吸收峰是5-FU中羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，同時(shí)在1 136 cm-1處有醚鍵的特征吸收峰，這表明5-FU是以成醚的方式與卟啉側(cè)端的乙氧鏈相連。而錳配合物、鋅配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)中，分別在1 010和997 cm-1處出現(xiàn)了新的強(qiáng)伸縮振動(dòng)吸收峰，該峰歸屬于卟啉環(huán)內(nèi)Mn-N鍵和Zn-N鍵的振動(dòng)吸收，這表明卟啉環(huán)內(nèi)的2個(gè)氫原子被金屬取代形成了穩(wěn)定的金屬卟啉配合物。

2.3 核磁共振氫譜

3種化合物的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)列于合成部分，由數(shù)據(jù)可知:自由卟啉中環(huán)內(nèi)N-H的化學(xué)位移在-2.74處，與卟啉環(huán)上苯環(huán)相連的2個(gè)-CH2的化學(xué)位移值分別是4.10～4.12和4.30～4.31，5-FU中的C-H在7.99處出現(xiàn)，而5-FU中的N-H由于沒(méi)有處在屏蔽區(qū)，故它的δ為正，應(yīng)在9以上。但由于受溶劑的影響，積分比又小，該峰未顯示出來(lái)。再對(duì)比鋅配合物的氫譜數(shù)據(jù)，與鋅離子配位后，吡咯環(huán)內(nèi)NH的化學(xué)位移消失，這是形成金屬鋅卟啉配合物的重要證據(jù)[17]。

2.4 熒光光譜

卟啉具有典型的雙熒光性質(zhì)(S2→S0和S1→S0)。通常，S2→S0熒光只有在低溫和極稀的溶液中才能得到，本實(shí)驗(yàn)得到的是S1→S0熒光。圖1只給出了自由卟啉和鋅配合物的熒光發(fā)射光譜圖。從圖1可知，自由卟啉的發(fā)射峰位于651和715 nm處，與吸收光譜中Q帶成鏡像對(duì)稱(chēng)。而鋅配合物的發(fā)射峰出現(xiàn)在599、645 nm處，與自由卟啉相比，熒光特征峰藍(lán)移50～60 nm，同時(shí)熒光強(qiáng)度減弱，說(shuō)明鋅配合物具有一定的熒光猝滅性質(zhì)[17]。這是由于當(dāng)卟啉環(huán)與鋅配位后，吡咯N原子通過(guò)σ電子的給予與Zn2+形成配位鍵，同時(shí)，Zn2+通過(guò)d電子的給予與N原子形成反饋π鍵，由于形成的反饋π鍵可以使卟啉環(huán)上的共軛體系的π電子密度增加，從而使熒光特征峰峰位發(fā)生改變并產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。而具有順磁性的錳配合物卻觀察不到熒光發(fā)射光譜，這是因?yàn)轫槾判越饘龠策浜衔镏笑?π*激發(fā)單重態(tài)與中心金屬的多重態(tài)之間發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，使系間竄躍速率增大，導(dǎo)致最低激發(fā)單重態(tài)到基態(tài)的躍遷幾率降低，產(chǎn)生熒光猝滅[18]。

圖1 化合物L(fēng)(a)、ZnL(b)的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of compounds L(a)and ZnL(b)

2.5 電化學(xué)性質(zhì)

為了研究金屬離子對(duì)卟啉配合物電化學(xué)性質(zhì)的影響，用循環(huán)伏安法測(cè)試了3種化合物的電化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定結(jié)果及循環(huán)伏安曲線分別見(jiàn)表1和圖2。從圖2可以看出，自由卟啉和鋅配合物圖形相似，在負(fù)電位區(qū)間，均呈現(xiàn)2對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，對(duì)應(yīng)于2個(gè)單電子還原過(guò)程。在正電位區(qū)間，自由卟啉呈現(xiàn)1對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，而鋅配合物呈現(xiàn)2對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰。由表1可以看出，化合物L(fēng)和ZnL的第一氧化峰和第一還原峰的差值分別為2.24和2.14 V，這與通常用來(lái)鑒定卟啉環(huán)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的ΔE1/2=(2.25±0.15)V相一致[19]，也與Zemer等[20]的分子軌道理論計(jì)算值2.18 V一致。說(shuō)明自由卟啉與鋅配合物具有相同的電極反應(yīng)過(guò)程，電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)在卟啉環(huán)上進(jìn)行，被氧化成π陽(yáng)離子或還原為π陰離子，并進(jìn)一步還原為二價(jià)陰離子。

表1 化合物L(fēng)、MnL和ZnL在CH 2Cl2溶劑中的氧化還原電勢(shì)數(shù)據(jù)Table 1 Redox potentials of L,MnL and ZnL in CH 2Cl2 V

圖2 化合物L(fēng)(a)、MnL(b)和ZnL(c)的循環(huán)伏安曲線圖Fig.2 Cyclic voltammograms of compounds L(a),MnL(b)and ZnL(c)

錳配合物MnL的循環(huán)伏安曲線形狀與自由卟啉相差很大?；谥行慕饘匐x子先于卟啉環(huán)氧化還原的觀點(diǎn)，可認(rèn)為其第一還原反應(yīng)發(fā)生在金屬M(fèi)n上，而其它氧化還原反應(yīng)發(fā)生在卟啉環(huán)上[21]。

從表1還可以看出，自由卟啉的第一還原半波電位E1/2為-1.23 V，而錳配合物與鋅配合物的第一還原半波電位E1/2分別變?yōu)?1.52和-1.40 V，這是因?yàn)檫策潴w與金屬離子配位后對(duì)稱(chēng)性增大，卟啉環(huán)更加穩(wěn)定，還原較難進(jìn)行，因而需要更高的負(fù)電位才能將其還原[22]。

2.6 目標(biāo)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性

采用SRB法測(cè)定了3個(gè)化合物對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株Bel7402和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知:(1)樣品濃度為10μg·mL-1時(shí)，3個(gè)化合物對(duì)Bel7402和HCT-8均有一定的抑制作用，而MnL對(duì)A549有一定抑制作用，自由卟啉和鋅配合物對(duì)A549的抑制率為負(fù)值。3個(gè)化合物抑制活性均低于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶，分析原因可能是目標(biāo)化合物對(duì)細(xì)胞株的抑制有很強(qiáng)的選擇性，對(duì)上述3種細(xì)胞株選擇性較差，對(duì)其他細(xì)胞株的抑制活性將在后續(xù)工作中進(jìn)行。(2)錳配合物對(duì)3種細(xì)胞株的抑制率明顯高于自由卟啉和鋅配合物，抑制率分別為24.32%、34.16%和23.54%，說(shuō)明卟啉化合物的抗腫瘤活性與中心金屬離子有關(guān)，錳卟啉對(duì)癌細(xì)胞的抑制活性較鋅卟啉和自由卟啉要高很多，這與文獻(xiàn)[16]所得結(jié)論一致。(3)錳配合物對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549的抑制率最高，為34.16%，也表明卟啉化合物的抗腫瘤活性具有一定的選擇性，對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理可能不一樣。(4)與文獻(xiàn)[16]對(duì)比，發(fā)現(xiàn)抑制率均低于文獻(xiàn)值，說(shuō)明當(dāng)苯環(huán)上連有給電子基時(shí)對(duì)這3種細(xì)胞株的抑制率較大。與腫瘤DNA作用機(jī)制可能是:卟啉化合物優(yōu)先以空間匹配及靜電作用與DNA螺旋小溝中連續(xù)的AT(A=腺嘌呤，T=胸腺嘧啶)富堿基區(qū)域進(jìn)行溝槽結(jié)合[23]，其抗腫瘤活性與它們和DNA相互作用的強(qiáng)弱、結(jié)合模式及中心金屬離子種類(lèi)均有關(guān)。

表2 化合物L(fēng)、MnL和ZnL對(duì)A549、Bel7402和HCT-8的抑制率Table 2 Inhibition rates of L,MnL and ZnL to A549,Bel7402 and HCT-8%

3 結(jié) 論

通過(guò)親核取代反應(yīng)合成了5-氟尿嘧啶修飾的自由卟啉L及其金屬配合物MnL和ZnL，采用現(xiàn)代分析測(cè)試手段表征了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。研究了目標(biāo)化合物的熒光性質(zhì)和電化學(xué)性質(zhì)；測(cè)試了它們的抗癌活性。結(jié)果表明:金屬離子對(duì)卟啉的熒光性質(zhì)有顯著影響，鋅配合物熒光強(qiáng)度減弱，而具有順磁性的錳配合物熒光信號(hào)消失；錳配合物的循環(huán)伏安曲線與自由卟啉、鋅配合物不同，除了卟啉環(huán)發(fā)生氧化還原外，還發(fā)生了金屬離子的氧化還原反應(yīng)；錳配合物較其他2種化合物有明顯的抗癌作用。

致謝:抑制活性由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心測(cè)試，特此感謝。