TMPRSS2-ERG融合基因與轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌化學(xué)藥物治療后生存率的關(guān)系

謝英偉 金仕鵬 李 爽 王永輝 王 偉 平 浩 劉躍新

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌是目前全球男性最常見的惡性腫瘤之一。隨著疾病的進(jìn)展，多數(shù)前列腺癌將轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌 (metastatic castration resistant prostate cancer，mCRPC)[1]，目前，多西他賽為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者的一線治療藥物[2]。然而約50%的患者對(duì)化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)先天耐受，起初對(duì)化療敏感的患者最終也會(huì)發(fā)展為化療耐受。臨床觀察[3]和實(shí)驗(yàn)研究[4]表明化療耐藥與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如化療耐藥的腫瘤易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的腫瘤具有更強(qiáng)的化療耐藥性。本課題組[5]研究發(fā)現(xiàn)TMPRSS2-ERG(T-E)融合基因更易出現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌中。本研究對(duì)前列腺癌化療患者進(jìn)行融合基因的測(cè)定，以評(píng)估融合基因與化療耐藥之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院前列腺增生患者20例，前列腺癌化療患者50例為研究對(duì)象，前列腺增生患者平均年齡(73.58±5.88)歲，前列腺癌化療的患者骨轉(zhuǎn)移者43例，骨及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者7例，平均年齡(75.22±5.61)歲。前列腺癌化療患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診時(shí)有明確的經(jīng)前列腺穿刺活檢或手術(shù)標(biāo)本確診為前列腺癌的病理報(bào)告；②行全身骨掃描，胸、腹部CT檢查明確有骨和(或)內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者，M分期為Mlb、Mlc的轉(zhuǎn)移患者；③均經(jīng)過藥物或手術(shù)去勢(shì)后出現(xiàn)前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)緩解一段時(shí)間后再升；④均有明確初始PSA值及化療前PSA值；⑤確診時(shí)具有以Gleason評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)的前列腺癌病理分級(jí)；⑥患者均符合mCRPC，剔除行二線內(nèi)分泌或其他治療方法，均行多西他賽聯(lián)合潑尼松全身化療方案者。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA的提取

化療開始前，利用EDTA管收集外周血樣10 mL。將樣品在4 ℃保存最多2 h直至處理。用吸管小心加到相對(duì)體積質(zhì)量為1.072的淋巴細(xì)胞分離液的離心管液面上。離心后，分離外周血單核細(xì)胞，并使用TRI-Reagent(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)根據(jù)制造商的說明提取總RNA。通過ND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop 科技公司)定量RNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

使用High Capacity cDNA Archive Kit(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)對(duì)0.5 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用TaqMan PreAmp Master Mix Kit(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，將T-E和管家基因GUSB預(yù)擴(kuò)增14個(gè)循環(huán)，不同的是反應(yīng)的最終體積減少至12.5 μL。在StepOne Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Life科技公司)中進(jìn)行qRT-PCR。使用SDS軟件1.4獲取數(shù)據(jù)。擴(kuò)增反應(yīng)一式兩份進(jìn)行。表達(dá)值基于靶基因相對(duì)于GUSB內(nèi)源基因的Cq的定量循環(huán)(Cq)。商業(yè)引物和探針用于擴(kuò)增T-E和GUSB基因(分別為Hs03063375_ft和Hs99999908_m1; 美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。本研究分別使用T-E和GUSB的閾值0.1和0.2來記錄Cq數(shù)據(jù)。

1.2.3T-E分類

當(dāng)在一式兩份反應(yīng)中檢測(cè)到T-E基因和管家基因GUSB(Cq≤35)時(shí)，患者歸類為T-E陽性。 當(dāng)可檢測(cè)到GUSB但未檢測(cè)到T-E(未確定的Cq)時(shí)，患者歸類為T-E陰性。

1.3 隨訪和評(píng)估

每3～6周測(cè)量PSA濃度，并且每2～4個(gè)月或根據(jù)臨床情況進(jìn)行CT和/或骨掃描檢查。 PSA反應(yīng)率定義為在治療開始后的任何時(shí)間PSA從基線(維持>4周)至少減少50%。 PSA-無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)，放射學(xué)無進(jìn)展生存期(radiological progression free survival, RX-PFS)和總生存期(overall survival,OS)分別為從服用多西他賽開始計(jì)算到PSA進(jìn)展，放射學(xué)進(jìn)展和死亡或最后一次隨訪時(shí)。 治療反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)和疾病進(jìn)展性定義遵循前列腺癌臨床試驗(yàn)工作組標(biāo)準(zhǔn)[6]。PSA進(jìn)展定義為PSA值升高較最低值至少增加25%并在3周后確認(rèn)。放射學(xué)進(jìn)展定義為治療期間或治療后骨掃描顯示新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶≥2個(gè)，且在以后 (≥2個(gè)月)再次骨掃描時(shí)得到確認(rèn)，則為進(jìn)展；其他可測(cè)量轉(zhuǎn)移灶采用實(shí)體瘤的新反應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)(RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn))[7]，比較治療前后的CT或MRI檢查結(jié)果?；颊唠S訪時(shí)間直至死亡或最后一次就診。PSA倍增時(shí)間(PSA doubling time, PSADT)定義為化療前PSA達(dá)到最低值后再次測(cè)量PSA增2倍需要的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

在20例前列腺增生患者中未檢測(cè)到T-E融合基因。在50例多西他賽化療的mCRPC患者外周血中，10例(20.0%)檢測(cè)為T-E陽性，40例(80.0%)為陰性。根據(jù)T-E表達(dá)對(duì)患者進(jìn)行分組，除初始PSA、PSADT、激素敏感時(shí)間外，mCRPC患者的基線特征，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

表1T-E融合基因陽性與陰性組之間的腫瘤特征

FactorsT-E negative(n=40)T-E positive(n=10)tPFactors at diagnosis Age/a74.89±5.0176.25±7.560.16 PSA/(ng·mL-1)45.07±36.0481.86±135.920.02Gleason score0.010.94 ≤7276 >7134Factors at the start of chemotherapyPSADT/month27.53±17.6819.43±12.570.06ECOG score0.200.66 091 ≥1319Hormone sensitive time/month32.82±21.0521.05±15.120.04WBC/(109×L-1)6.89±4.736.57±4.140.71HB /(g·L-1)117.24±31.35112.31±34.640.67

T-E:TMPRSS2-ERG;PSA: prostate specific antigen;PSADT: prostate specific antigen doubling time;ECOGscore: Eastern Cooperative Oncology Group;WBC: white blood cell;HB:hemoglobin.

T-E陽性患者的PSA反應(yīng)率低于陰性患者(分別為32.52%和74.35%，P=0.040)(圖1)。T-E陽性患者的PSA-PFS，RX-PFS和OS低于陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2～4)。

圖1 T-E PSA反應(yīng)率Fig.1 PSA response rate in T-E T-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

圖2 PSA無進(jìn)展生存期Fig.2 PSA progession free survivalT-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

圖3 T-E患者的放射學(xué)無進(jìn)展生存期 Fig.3 RX-PFS in T-E positive and negative patientsT-E: TMPRSS2-ERG;RX-PFS:radiologic progression-free survival.

圖4 總生存期 Fig.4 Overall survivalT-E: TMPRSS2-ERG.

多因素Cox分析結(jié)果顯示，Gleason評(píng)分、PSADT、激素敏感時(shí)間、T-E與PSA-PFS，RX-PFS和OS相關(guān)(P<0.05),HB與OS相關(guān)(P<0.05)，詳見表2。

表2 mCRPC患者PSA-PFS，RX-PFS和OS的多因素Cox回歸分析

mCRPC:metastatic castration resistant prostate cancer;PSA:prostate specific antigen;PFS:progression free survival;RX-PFS:radiological progression free survival;OS: overall survival;PSADT:prostate specific antigen doubling time;ECOG:Eastern Cooperative Oncology Group;WBC:white blood cell;HB:hemoglobin.

3 討論

我國(guó)PSA篩查存在地區(qū)差異，高危進(jìn)展性及轉(zhuǎn)移性前列腺癌(metastatic prostate cancer，mPC)患者所占比例較高[8-9]。腫瘤耐藥是導(dǎo)致前列腺癌化療失敗的重要原因。

基因融合是指基因在染色體上發(fā)生位置錯(cuò)位、 融合的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生新的融合基因，該基因可能具有新的功能。T-E基因融合是前列腺癌中已知最常見的遺傳改變。T-E融合基因的發(fā)生率在不同人種之間存在明顯差異。歐美幾個(gè)研究中心樣本量超過500例的研究[10]顯示T-E融合基因發(fā)生率約為50%。陶晶等[11]、Qi等[12]及Dong等[13]在前列腺癌組織中T-E融合基因檢出率分別為19.8%、23.2%、14.3%。

在本研究中，20%的mCRPC患者檢測(cè)到T-E融合基因。分析融合基因與臨床結(jié)果的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)T-E融合基因陽性患者在多西他賽化療后PSA-PFS，RX-PFA和OS低于陰性組。這些結(jié)果表明T-E融合基因是預(yù)測(cè)mCRPC患者多西他賽化療耐藥的潛在生物標(biāo)志物。這與當(dāng)前部分結(jié)果研究一致。在Galletti等[14]的1項(xiàng)研究中，11例(32.4%)患者T-E融合陽性，ERG表達(dá)陽性患者對(duì)多西他賽的PSA反應(yīng)率與陰性相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(陽性45%vs陰性79%，P<0.05)。此外，Reig等[15]報(bào)道，50例多西他賽治療的mCRPC患者中有8例(16%)外周血中T-E融合基因陽性。這一發(fā)現(xiàn)也與較低的PSA反應(yīng)率：PSA-PFS、C/R-PFS和OS相關(guān)。研究[16]顯示外周血中檢測(cè)到的ERG表達(dá)與用多西他賽化療的mCRPC患者較低的PSA-PFS、C/R-PFS和OS相關(guān)。

目前關(guān)于T-E融合基因與前列腺癌化療耐藥的具體機(jī)制還沒有明確。Galletti等[14]證明ERG與可溶性微管蛋白結(jié)合并降低紫杉烷-微管蛋白相互作用，導(dǎo)致紫杉烷敏感性受損。此外，T-E誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這也與CRPC中的紫杉烷抗性有關(guān)[17]。

本研究雖然顯示T-E融合基因與前列腺癌化療耐藥有關(guān)，但是樣本量相對(duì)較小，而且融合基因陽性的患病率不高。同時(shí)這也是一個(gè)單中心的試驗(yàn)，可能對(duì)患者選擇有偏倚。下一步需要更大量的樣本及多中心的研究進(jìn)一步明確兩者之間的關(guān)系。

總之，本研究的結(jié)果表明，T-E融合基因的表達(dá)與多西他賽化療的mCRPC患者中較低的PSA-PFS、RX-PFS和OS相關(guān)。因此，它們可以用作預(yù)測(cè)mCRPC患者中多西紫杉醇治療的潛在生物標(biāo)志物。