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    微生物顯色法檢測(cè)禽畜肉中混合抗生素殘留

    2019-06-05 01:05:26高曉月范維陳淑敏李瑩瑩王守偉郭文萍
    肉類研究 2019年4期
    關(guān)鍵詞:畜禽肉高通量

    高曉月 范維 陳淑敏 李瑩瑩 王守偉 郭文萍

    摘 要:以微生物顯色為原理,建立一種對(duì)畜禽肉中單一或配伍使用的抗生素進(jìn)行聯(lián)合初篩的高通量方法,并用色譜法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證。以大腸埃希氏菌(Escherichia coli,CICC 23657)作為指示菌,選取適當(dāng)?shù)目股貧埩籼崛》椒?,并通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化檢測(cè)液配方及檢測(cè)體系組成,最終實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類別抗生素的聯(lián)合檢測(cè)。結(jié)果表明:選取檸檬酸-丙酮緩沖液進(jìn)行提取,提取效率達(dá)到86%~88%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%~4.3%;蛋白胨添加量為1.0 g/100 mL、溴甲酚紫指示劑添加量為2.0 mg/100 mL、pH值為7.2時(shí),檢測(cè)液顯色效果較好;菌懸液初始吸光度(A600 nm)為0.4,檢測(cè)液、菌液、樣品提取液體積為150 μL∶50 μL∶100 μL時(shí),檢測(cè)效果最佳,對(duì)畜禽肉中喹諾酮類抗生素的檢出限為60~180 μg/kg,氨基糖苷類檢出限為60~140 μg/kg,喹諾酮類與氨基糖苷類配伍使用時(shí)的檢出限為40~180 μg/kg;進(jìn)一步用色譜法對(duì)50 份樣品的初篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,無(wú)假陰性樣品存在,說(shuō)明該方法可用于畜禽肉中抗生素殘留的初篩。

    關(guān)鍵詞:微生物顯色法;畜禽肉;抗生素殘留;高通量

    Abstract: A new microbial chromogenic assay was developed for high throughput screening for single and compatible combinations of antibiotic residues in livestock and poultry meat, and it was validated by liquid chromatography (LC). Escherichia coli was used as the indicator strain to detect a variety of antibiotics simultaneously. The optimal extraction conditions were determined and the reaction system and conditions were optimized by one-factor-at-a-time method. The results showed that citric acid-acetone mixture was the solvent of choice for the extraction procedure, giving an extraction efficiency of 86%–88% with a relative standard deviation ranging from 3.9% to 4.3%. Addition of 1.0 g/100 mL of peptone and?2.0 mg/100 mL of bromocresol purple and pH adjustment to 7.2 were found to be the optimal conditions for chromogenic reaction. The optimal detection conditions were as follows: initial absorbance value (A600 nm) of bacterial suspension 0.4, and ratio of reaction system to bacterial suspension to sample extract 150:50:100 (V/V). The limit of detection of the proposed method was 60–180, 60–140 and 40–180 μg/kg for quinolones, aminoglycosides and their combinations in livestock and poultry meat, respectively. For 50 positive samples with antibiotic residue determined by the microbial chromogenic assay, no false negative results were obtained.? Thus this assay can be used in screening for antibiotic residues in livestock and poultry meat.

    Keywords: microbial chromogenic assay; livestock and poultry meat; antibiotic residues; high-throughput

    DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20190222-032

    中圖分類號(hào):TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8123(2019)04-0036-06

    喹諾酮類抗生素是一類廣譜抗生素,在畜禽獸藥中得到廣泛應(yīng)用[1-3],用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病或微生物污染以及作為膳食補(bǔ)充劑[4-6]。相關(guān)研究[7-8]表明,畜禽肉中喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素的殘留率較高,這主要是因?yàn)閲?guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)為了縮短療程,降低藥物毒副作用,減少致病菌耐藥情況發(fā)生,常常把氨基糖苷類等抗生素與其配伍使用,這無(wú)形中加大了抗生素殘留檢測(cè)的難度,尋求高通量檢測(cè)方法將成為未來(lái)發(fā)展的主要方向[9-11]。抗生素殘留的檢測(cè)方法包括微生物檢測(cè)法、免疫分析法和色譜法[12-14]。在這3 類方法中,色譜法和免疫分析法具有靈敏性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),但是均存在檢測(cè)具有單一性、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備投入大和對(duì)技術(shù)人員要求高等問(wèn)題[15-17],不能滿足高通量、快速檢測(cè)的發(fā)展需要。相較于以上2 種方法,微生物檢測(cè)法在應(yīng)用中具有操作便捷、成本較低、有廣泛篩查性的特點(diǎn)[18-20],可作為一種高通量初篩方法用于畜禽肉中抗生素殘留的檢測(cè),在中小型禽畜肉養(yǎng)殖加工企業(yè)中具有良好的推廣前景。

    目前,在我國(guó)微生物顯色法主要采用嗜熱脂肪芽孢桿菌[21-23]、蠟樣芽孢桿菌[24]等作為指示菌對(duì)原料乳中殘留的青霉素類抗生素進(jìn)行檢測(cè),在畜禽肉中應(yīng)用較少[25-27],主要原因有兩點(diǎn):一是由于畜禽肉的體系較復(fù)雜,抗生素提取存在困難;二是由于現(xiàn)有指示菌對(duì)禽畜肉中常見的喹諾酮類抗生素不敏感。因此,本研究針對(duì)以上技術(shù)難題選擇大腸埃希氏菌為指示菌[28-29],開發(fā)適合畜禽肉中抗生素殘留檢測(cè)的提取方法,并優(yōu)化檢測(cè)液配方及檢測(cè)體系組成,建立一種可同時(shí)對(duì)畜禽肉中喹諾酮類及常與其配伍使用的氨基糖苷類抗生素進(jìn)行聯(lián)合初篩的高通量方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種與樣品

    大腸埃希氏菌(Escherichia coli)由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供、菌號(hào)為CICC 23657的標(biāo)準(zhǔn)菌株;禽畜肉購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

    1.1.2 試劑

    喹諾酮類:恩諾沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星、麻保沙星、達(dá)氟沙星、氟甲喹、二氟沙星;氨基糖苷類:慶大霉素、鏈霉素、新霉素、安普霉素、丁胺卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、溴甲酚紫指示劑、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violt red bile agar,VRBA) 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑為分析純或色譜純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ESJ120-4電子天平 龍騰儀器有限公司;PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;UltiMate 3000高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備電噴霧離子源)、1510-07269C酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;BPC-150F培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;KDC-140HR離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品處理

    1.3.1.1 溶液配制

    標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:準(zhǔn)確量取各抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用去離子水稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:準(zhǔn)確量取各抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,兩兩等體積混合,用去離子水稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    檸檬酸-丙酮緩沖溶液的配制:將0.2 mol/L檸檬酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鉀溶液等體積混合,向35 mL混合液中加入35 mL丙酮和30 mL蒸餾水,充分混勻。

    檸檬酸-乙醇緩沖溶液的配制:將0.2 mol/L檸檬酸溶液和0.5 mol/L氫氧化鉀溶液等體積混合,向35 mL混合液中加入35 mL乙醇和30 mL蒸餾水,充分混勻。

    檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液的配制:將0.2 mol/L磷酸氫二鈉16.47 mL、0.1 mol/L檸檬酸3.53 mL充分混勻。

    1.3.1.2 樣液提取

    取3 個(gè)50 mL離心管,分別加入10 g均質(zhì)好的肌肉組織樣品,再向各管中分別加入20 mL檸檬酸-丙酮緩沖溶液、20 mL檸檬酸-乙醇緩沖溶液和20 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液,用漩渦振蕩器振蕩3 min,充分振蕩后于70~75 ℃水浴20 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液作為樣液。

    1.3.1.3 提取液的選擇

    對(duì)3 種提取液(檸檬酸-丙酮緩沖溶液、檸檬酸-乙醇緩沖溶液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液)的蛋白沉淀效果進(jìn)行比較,并將各上清液進(jìn)行色譜法測(cè)定,確定不同提取液中各類抗生素的提取效率,最終選取適宜的抗生素提取液。

    1.3.2 檢測(cè)液配方優(yōu)化

    檢測(cè)液配制方法為:蛋白胨0.5~2.0 g、溴甲酚紫指示劑2.0~8.0 mg、葡萄糖1.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉浸膏0.3 g、加水定容至100 mL,pH值調(diào)至6.8~7.4,加熱煮沸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌15 min。

    1.3.2.1 反應(yīng)變色時(shí)間及指示菌菌落總數(shù)的確定

    按檢測(cè)液∶菌懸液∶生理鹽水體積比3∶1∶2的比例進(jìn)行混合后,于36 ℃恒溫培養(yǎng),確定變色(檢測(cè)液由紫紅色變黃色)時(shí)間。之后取1 mL進(jìn)行梯度稀釋,選擇適宜的稀釋度,傾注于平皿中,倒入VRBA液體培養(yǎng)基,充分混勻,待瓊脂凝固后,再加入3~4 mL VRBA覆蓋平皿表層,翻轉(zhuǎn)平板,置于36 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù),確定指示菌生長(zhǎng)情況。

    1.3.2.2 蛋白胨添加量的確定

    在100 mL檢測(cè)液中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 g的蛋白胨,滅菌冷卻后按照1.3.2.1節(jié)的方法進(jìn)行變色時(shí)間和菌落總數(shù)測(cè)定,選取蛋白胨的最佳加入量。

    1.3.2.3 溴甲酚紫添加量的確定

    分別取2.0、4.0、6.0、8.0 mg溴甲酚紫指示劑添加到100 mL檢測(cè)液中,按照1.3.2.1節(jié)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),選取指示劑的最佳加入量。

    1.3.2.4 檢測(cè)液初始pH值的確定

    將檢測(cè)液初始pH值分別調(diào)為6.8、7.0、7.2、7.4,按照1.3.2.1節(jié)的方法進(jìn)行變色時(shí)間和菌落總數(shù)測(cè)定,從而選取最適的檢測(cè)液初始pH值。

    1.3.3 菌懸液初始吸光度測(cè)定和檢測(cè)體系組成的確定

    無(wú)菌狀態(tài)下,挑取已培養(yǎng)好的指示菌菌落接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,配制成不同初始吸光度(A600 nm)的菌懸液,其吸光度分別為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0,加入到以下3 組體系中,體系比例如表1所示,于36 ℃恒溫培養(yǎng),確定各組檢測(cè)液的變色時(shí)間。選擇變色時(shí)間較短的檢測(cè)體系組成,將體系中的生理鹽水換成等體積的0.1 μg/mL環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或環(huán)丙沙星與鏈霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于同一溫度下恒溫培養(yǎng),進(jìn)行抗生素敏感性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),觀察變色情況,選出檢測(cè)液仍呈紫色組,最終確定最適的菌懸液初始吸光度及檢測(cè)體系組成。

    1.3.4 微生物顯色法檢測(cè)

    按樣品數(shù)取出所需數(shù)量的微孔板,將樣品和對(duì)照組對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣品和對(duì)照做2 孔平行。按照1.3.3節(jié)優(yōu)化的比例,向各微孔中依次加入檢測(cè)液和菌懸液,再按照編號(hào)向各微孔中加入陽(yáng)性對(duì)照(不同抗生素標(biāo)準(zhǔn)液)、陰性對(duì)照(無(wú)抗生素殘留的肉提取液)、空白對(duì)照(生理鹽水)及樣液,于36 ℃恒溫培養(yǎng),觀察變色情況。當(dāng)陰性對(duì)照孔變成黃色時(shí),觀察其他樣品孔顏色變化。

    1.3.5 抗生素檢出限的確定

    1.3.5.1 單標(biāo)檢出限確定

    用去離子水對(duì)12 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度稀釋,稀釋成10 個(gè)梯度。按上述微生物法進(jìn)行檢測(cè),確定各種抗生素的檢出限。

    1.3.5.2 聯(lián)用檢出限確定

    對(duì)常配伍使用的喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素進(jìn)行混合,使2 種抗生素在混合體系中的終質(zhì)量濃度均為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/mL,具體如表2所示。按上述微生物法進(jìn)行檢測(cè),確定各種聯(lián)用抗生素檢出限。

    1.3.6 樣品的測(cè)定

    將50 份樣品按照1~50進(jìn)行編號(hào),為保證一定的陽(yáng)性檢出比例,部分樣品采用人工添加的方式。用微生物顯色法進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和繪圖均采用Origin 8.0數(shù)據(jù)分析軟件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗生素提取液的確定

    通過(guò)觀察3 種提取液的蛋白沉淀效果發(fā)現(xiàn),檸檬酸-丙酮緩沖溶液沉淀蛋白效果較好,上清液呈無(wú)色澄清狀,其他2 種提取液處理的樣品上清液呈微紅色,并有少許殘?jiān)嬖?。取上清液進(jìn)行色譜法檢測(cè),由表3可知,檸檬酸-丙酮緩沖溶液的提取率及穩(wěn)定性均較高,因此,選擇檸檬酸-丙酮緩沖溶液作為提取液。

    2.2 檢測(cè)液配方優(yōu)化結(jié)果

    2.2.1 蛋白胨添加量的確定結(jié)果

    由圖1可知,隨著蛋白胨添加量的增加,菌落總數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì),這與劉冬梅等[30]的研究結(jié)果相似。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0 g/100 mL時(shí),菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值最高,達(dá)7.81 (lg(CFU/mL)),之后隨著蛋白胨添加量的提高,培養(yǎng)基的pH值降低,從而影響了菌種的生長(zhǎng)繁殖。從反應(yīng)時(shí)間上看,菌落總數(shù)越高,檢測(cè)液變色時(shí)間相對(duì)越短,這主要是由于較高濃度的指示菌產(chǎn)酸較多,使指示劑變色較快。因此選擇蛋白胨添加量為1.0 g/100 mL。

    2.2.2 溴甲酚紫添加量的確定結(jié)果

    由圖2可知:當(dāng)溴甲酚紫指示劑的添加量為2.0、4.0 mg/100 mL時(shí),檢測(cè)液的初始顏色呈紫色,反應(yīng)終點(diǎn)顏色變成黃色,區(qū)分度明顯[31],且反應(yīng)時(shí)間可控制在4 h內(nèi);隨著溴甲酚紫指示劑添加量的提高,檢測(cè)液初始顏色呈紫黑色,終點(diǎn)顯色不明顯,且變色時(shí)間較長(zhǎng),因此選擇溴甲酚紫添加量為2.0 mg/100 mL。

    2.2.3 檢測(cè)液初始pH值的確定結(jié)果

    溴甲酚紫指示劑的變色范圍是pH值5.2~6.8,為了保證指示劑正常變色,將檢測(cè)液初始pH值設(shè)定為高于6.8。由圖3可知,當(dāng)檢測(cè)液初始pH值為7.2時(shí),菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到最高,說(shuō)明該pH值是指示菌生長(zhǎng)的最適pH值。并且從反應(yīng)時(shí)間可知,隨著檢測(cè)液初始pH值的升高,反應(yīng)時(shí)間隨之延長(zhǎng),當(dāng)pH值小于7.2時(shí),反應(yīng)時(shí)間可以控制在4 h內(nèi)。由于抗生素對(duì)微生物的抑制作用需要一定的反應(yīng)時(shí)間[32],為防止由于檢測(cè)液初始pH值設(shè)定過(guò)低,導(dǎo)致藥效沒(méi)產(chǎn)生之前指示菌的產(chǎn)酸量就使其變色,失去檢測(cè)意義,因此選擇最適檢測(cè)液初始pH值為7.2。

    2.3 菌懸液初始吸光度和檢測(cè)體系組成的確定結(jié)果

    用生理鹽水作為樣品提取液,確定菌懸液初始吸光度和檢測(cè)體系組成對(duì)檢測(cè)液變色時(shí)間的影響。由表4可知,當(dāng)菌懸液初始吸光度不小于0.4時(shí),B、C組均能在4 h內(nèi)變色。因此,用B、C 組檢測(cè)體系組成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),反應(yīng)時(shí)間較短。

    由表5可知,對(duì)于抗生素敏感性來(lái)說(shuō),菌懸液初始吸光度大于0.4或加入體積為80 μL時(shí),反應(yīng)終點(diǎn)檢測(cè)液變?yōu)辄S色,抗生素對(duì)菌的抑制效果不明顯,達(dá)不到檢測(cè)目的。因此選擇菌懸液初始吸光度為0.4,檢測(cè)液∶菌液∶樣品提取液為150 μL∶50 μL∶100 μL時(shí),檢測(cè)效果最佳。

    2.4 抗生素的檢出限

    按照1.3.5節(jié)的方法進(jìn)行檢測(cè),確定各抗生素的最小檢測(cè)濃度(顏色未發(fā)生變化時(shí)的抗生素標(biāo)準(zhǔn)液濃度)。由表6~7可知,本方法選擇的大腸埃希氏菌對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素均有較好抑制作用,其中喹諾酮類檢出限為60~180 μg/kg、氨基糖苷類檢出限為40~140 μg/kg,均低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[33],因此該法可以滿足喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素初篩檢測(cè)的要求。

    2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

    將50 份樣品用微生物顯色法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。由表8可知,采用微生物法測(cè)定時(shí),共有15 個(gè)樣品檢出結(jié)果呈陽(yáng)性,其中12 個(gè)陽(yáng)性樣品人為添加了抗生素,其余3 個(gè)樣品經(jīng)過(guò)與色譜方法比對(duì),發(fā)現(xiàn)是假陽(yáng)性樣品。用色譜法對(duì)35 個(gè)呈陰性樣品進(jìn)行驗(yàn)證,沒(méi)有測(cè)出以上藥物殘留,說(shuō)明該微生物顯色法無(wú)假陰性結(jié)果存在,結(jié)果較可靠。

    3 結(jié) 論

    以大腸埃希氏菌作為指示菌,選取檸檬酸-丙酮緩沖液作為提取液,通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化檢測(cè)液配方及檢測(cè)體系組成,選擇菌懸液初始吸光度為0.4,檢測(cè)液(蛋白胨含量1.0 g/100 mL、溴甲酚紫指示劑含量2.0 mg/100 mL、pH 7.2)∶菌液∶樣品提取液為150 μL∶50 μL∶100 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn),之后用色譜法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證。優(yōu)化后的檢測(cè)方法可在3~4 h內(nèi)使指示劑變色(檢測(cè)液由紫變黃),顏色變化明顯,易用肉眼區(qū)分。該方法適用于畜禽肉中喹諾酮類、氨基糖苷類單獨(dú)或二者配伍使用時(shí)抗生素殘留的檢測(cè),其檢出限均低于我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量,滿足初篩要求。用色譜法對(duì)微生物法測(cè)定結(jié)果呈陰性的35 個(gè)樣品進(jìn)行復(fù)測(cè),以上抗生素均未檢出,說(shuō)明該方法測(cè)定準(zhǔn)確性較高,沒(méi)有假陰性結(jié)果存在。本方法使用微孔板作為反應(yīng)器,微孔可根據(jù)樣品數(shù)量自由獨(dú)立拆分,可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè),不受樣品數(shù)量限制,便于操作者使用。此外,該方法所用試劑均以微升計(jì),較傳統(tǒng)微生物法省時(shí)、省力,且重復(fù)性較好,無(wú)需大型儀器[34],大大降低了檢測(cè)成本。因此,本研究建立的微生物顯色法可在中小型禽畜肉養(yǎng)殖加工企業(yè)中推廣,并可應(yīng)用在農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管環(huán)節(jié)中。

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