金釵石斛原球莖及幼苗快速繁殖體系的構建

黃 晶， 葉慶生

(1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學院， 廣東 廣州 510520； 2.華南師范大學 生命科學學院， 廣東 廣州 510631)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)是我國重要的傳統(tǒng)名貴中藥材，具益胃生津、滋陰清熱等功效，對心血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及眼科疾病有明顯的輔助治療作用[1-2]。因其花色鮮艷、花姿優(yōu)美而成為世界著名的觀賞花卉。金釵石斛不僅具有重要的經濟價值和較高的觀賞價值，同時因其是軟莖類石斛重要的育種親本[3]，因此還具有較高的科研價值。金釵石斛主要分布于我國臺灣、海南、貴州、福建、湖南、湖北、廣西、云南及四川等長江以南的亞熱帶地區(qū)[4]，對生長環(huán)境要求較高，生長緩慢，自然繁殖率低，加上生態(tài)環(huán)境的惡化及長期過度采集，其野生資源日趨稀少[5]。作為國家重點保護野生藥材珍貴品種，研究金釵石斛的種質保存、品種改良和快速繁殖技術在生產應用上具有重要作用，采用無性繁殖技術加快人工種苗的供給已成為當務之急。近年來，國內外對石斛的一些珍貴種類進行組織培養(yǎng)及商品化生產研究[6-8]，但不同種或品種對萌發(fā)營養(yǎng)的需求存在較大差異。若想達到石斛蘭的規(guī)?；?、產業(yè)化發(fā)展目標，需要根據種類和預期達到的觀賞目的有針對性地制定不同的組織培養(yǎng)方案。鑒于此，筆者采用組織培養(yǎng)方法研究金釵石斛原球莖及幼苗的快速繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 金釵石斛保存于華南師范大學生命科學院蘭花中心。

1.1.2 試劑酒精、瓊脂、蔗糖、1/2MS培養(yǎng)基、6-BA、NAA、IBA和活性炭(北京鼎國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理取當年成熟且未開裂的蒴果，小刀切去果莢上有傷痕容易藏菌的部分后，用70%酒精浸泡5～8 min，灼燒后用解剖刀切開蒴果，得到無菌種子。將無菌種子均勻播散于1/2MS基本培養(yǎng)基上，添加瓊脂0.7%，蔗糖2%，pH 5.6。種子轉綠萌發(fā)但還未分化出頂芽時即得原球莖，原球莖分散在經高溫滅菌的1%的瓊脂溶液中，制成一定濃度的原球莖懸浮液備用。取33 mL培養(yǎng)基置玻璃瓶中，采用121℃滅菌20 min備用。

1.2.2 不同培養(yǎng)條件對原球莖增殖的影響采用3因素試驗(表1)，其中：A，培養(yǎng)基，固體(A1)和液體(A2)的1/2MS培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基再加瓊脂0.7%；B，6-BA，濃度分別為0.5 mg/L、1 mg/L和2.0 mg/L；C，NAA，濃度分別為0.5 mg/L、1 mg/L和2.0 mg/L。每瓶培養(yǎng)基中按試驗設計分別加入6-BA和NAA，然后再加入蔗糖2%，pH 5.6。每瓶培養(yǎng)基加入5 mL懸浮液(含原球莖約400粒)，每個處理8瓶，3次重復。培養(yǎng)條件：光照強度50～60 μmol/(m2·s)，光照時間 12 h/d，溫度(25±2)℃(下同)。液體培養(yǎng)基需放在震蕩培養(yǎng)箱上進行懸浮培養(yǎng)，轉速120 r/min。增殖培養(yǎng)20 d后進行稱重，觀察培養(yǎng)基物理狀態(tài)、不同激素濃度及配比對原球莖增殖和生長的影響。

表1金釵石斛原球莖增殖培養(yǎng)的試驗方案

Table 1 Experimental scheme for proliferation culture ofD.nobile

處理Treatments液態(tài)/固態(tài)培養(yǎng)基Liquid/solid culture medium6-BANAA12.00.521.00.530.51.040.52.0

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對幼苗生長的影響種子在1/2MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)長出綠色的原球莖，將原球莖分瓶培養(yǎng)一段時間后，取剛剛長出頂芽且生長一致的原球莖進行幼苗生長培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選。

1) 瓊脂。試驗設4個處理，即在1/2MS基本培養(yǎng)基中，蔗糖濃度為2%，瓊脂濃度分別為0.5%、0.6%、0.7%和0.8%。

2) 蔗糖。試驗設4個處理，即在1/2MS基本培養(yǎng)基中，瓊脂濃度為0.7%，蔗糖濃度分別為1%、2%、3%和4%。

3) 椰汁。在1/2MS基本培養(yǎng)基中，瓊脂濃度為0.7%，蔗糖濃度為2%，椰汁濃度分別為0、10%和20%，以未添加椰汁為對照(CK)。配好后的培養(yǎng)基pH 5.6。

取33 mL上述培養(yǎng)基于玻璃瓶中，將原球莖長成的幼苗每瓶接種5株，每個處理8瓶，3次重復。每月更換培養(yǎng)基，記錄幼苗生長情況。3個月后統(tǒng)計小苗莖高、莖粗、葉片數、葉長、生根數、根長及根粗等指標，通過對試驗結果進行統(tǒng)計分析篩選幼苗生長的最佳培養(yǎng)方案。

1.2.4 激素和活性炭對幼苗生根的影響原球莖在未添加椰汁和植物激素的1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月，當苗生長達1 cm左右時，取生長一致、健壯的小苗進行生根培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選。以1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，瓊脂濃度0.7%，蔗糖濃度2%，pH 5.6。

1) NAA。設3個處理N1～N3，在培養(yǎng)基中加入NAA濃度分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對照(CK1)。

2) IBA。設3個處理T1～T3，在培養(yǎng)基中加入IBA濃度分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對照(CK2)。

3) 活性炭(AC)。設4個處理A1～A4，在培養(yǎng)基中加入活性炭濃度分別為0.2 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L和2.0 g/L。以未添加NAA、IBA以及活性炭處理作對照(CK3)。

采用盛有33 mL培養(yǎng)基的玻璃瓶培養(yǎng)，每瓶5株，每個處理8瓶，3次重復。每45 d更換培養(yǎng)基，記錄幼苗生長情況。3個月后，統(tǒng)計小苗生根數、根長和根粗，通過統(tǒng)計分析篩選幼苗生根的最佳培養(yǎng)方案。

1.3 數據分析

用EXCEL和SPSS數據處理軟件對所有數據進行方差分析，并采用Duncan最小顯著差數測驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件原球莖的增殖培養(yǎng)

從圖1可見，金釵石斛的種子呈淡黃綠色，播種4周后，胚膨大脹破種皮，長成綠色圓球莖。液體和固體培養(yǎng)基對原球莖生長有很大的影響，二者間差異極顯著。液體培養(yǎng)基明顯地促進原球莖的生長，在液體培養(yǎng)基中長成的原球莖體積約為固體培養(yǎng)基中的5～10倍，顏色嫩綠，雖然在搖床上培養(yǎng)，但仍能呈現形態(tài)極性，培養(yǎng)20 d后球莖頂端分化出芽，側部突起產生第一葉原基；相比之下，固體培養(yǎng)基中的原球莖生長很慢，個體較小。從表2看出，不同激素濃度和配比對原球莖的生長也有影響。其中，固體培養(yǎng)基不同激素配比對原球莖生長的影響處理間差異較小，除處理3(即6-BA、NAA濃度分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L)原球莖的生長顯著優(yōu)于其余3個處理外，其余3個處理間差異不顯著；液體培養(yǎng)基不同激素配比對原球莖生長的影響處理間差異相對較大，各處理原球莖的生長量依次為處理3(即6-BA、NAA濃度分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L)>處理4(6-BA、NAA分別為0.5 mg/L和2.0 mg/L)>處理1(6-BA、NAA分別為2.0 mg/L和0.5 mg/L)>處理2(6-BA、NAA分別為1.0 mg/L和0.5 mg/L)，處理3原球莖的生長量最大，為0.355 g，顯著高于處理1和處理2，處理4顯著高于處理2。

注：A，未進行增殖培養(yǎng)的原球莖；B，液體和固體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)20 d后的原球莖(左邊為固體培養(yǎng)基，右邊為液體培養(yǎng)基)；C，不同6-BA和NAA濃度的液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)20 d后的原球莖，從左到右6-BA、NAA濃度依次為2 mg/L和0.5 mg/L，1 mg/L和0.5 mg/L，0.5 mg/L和1 mg/L，0.5 mg/L和2 mg/L。

Note: A，protocorms before proliferation culture; B，protocorm after 20 days proliferation on liquid or solid culture medium (left，solid culture medium; right，liquid culture medium); C，protocorm after 20 days proliferation on liquid culture medium with different concentration of 6-BA/NAA，concentrations of 6-BA/NAA are 2/0.5，1/0.5，0.5/1 and 0.5/2 mg/L from left to right，respectively.

圖 1不同培養(yǎng)條件金釵石斛原球莖的增殖狀況

Fig.1 Proliferation ofD.nobileprotocorm in different culture conditions

表26-BA、NAA各濃度配比及不同培養(yǎng)基物理狀態(tài)處理金釵石斛原球莖的生長

Table 2 Growth status ofD.nobileprotocorm with various 6-BA, NAA concentration ratio and physical condition of different medium

g

注：表中數據為平均值±標準誤；同列不同小寫字母表示P<0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: Data in the table are average ± standard error; Values with different small letter in the same column have significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 不同培養(yǎng)條件幼苗的生長

從表3看出，不同培養(yǎng)條件下金釵石斛幼苗生長存在一定差異。

2.2.1 瓊脂培養(yǎng)基中添加不同含量的瓊脂金釵石斛幼苗的生長存在差異。隨著瓊脂含量增加，金釵石斛幼苗的莖高、莖粗、葉數、葉長、生根數、根長及根粗均呈減少趨勢。其中，當瓊脂含量為0.5%時，培養(yǎng)基水分含量高，此時幼苗生長最快，培養(yǎng)3個月后其莖高、莖粗、葉長、生根數及根長分別為2.34 cm、0.288 cm、1.67 cm、5.25根和3.56 cm，均顯著高于其余3個處理，且葉片生長快，顏色鮮綠，光澤度好。說明，瓊脂濃度越低，培養(yǎng)基越軟，越有利于金釵石斛幼苗莖葉和根的生長。

2.2.2 蔗糖培養(yǎng)基中添加蔗糖的濃度不同對金釵石斛幼苗莖和葉的生長影響不顯著，但對根的生長有影響明顯。當蔗糖濃度低至1%時，葉片生長較快，但水分含量高，植株較脆弱且有玻璃化的現象；當蔗糖濃度為2%時，其葉長為1.28 cm，顯著高于其余3個處理；當蔗糖濃度升至4%時，葉的生長受阻，葉片短小，呈現一定的黃化狀態(tài)。蔗糖濃度為2%或3%時，幼苗莖葉生長較好。隨著蔗糖濃度增加，金釵石斛幼苗的生根數、根長及根粗均呈增加趨勢，高濃度的蔗糖雖然抑制地上部分生長但卻有利于根生長。蔗糖濃度為4%時金釵石斛幼苗的生根數、根長及根粗均最大，分別為6.38條、3.47 cm和0.100 cm，其生根數顯著高于其余3個處理，根長及根粗顯著高于濃度1%和濃度2%處理。綜合莖、葉和根的生長考慮，金釵石斛幼苗培養(yǎng)最佳蔗糖濃度為3%。

2.2.3 椰汁培養(yǎng)基中添加椰汁對金釵石斛幼苗生長有很大的促進作用，即隨著椰汁濃度升高，金釵石斛幼苗的莖高、莖粗、葉數、葉長、生根數、根長及根粗均呈增加趨勢。相比對照而言，添加椰汁的培養(yǎng)基，金釵石斛幼苗生長更快。培養(yǎng)3個月后，20%椰汁培養(yǎng)基中幼苗的莖高、葉長、生根數和根長明顯高于其余2個處理；其莖粗和葉數與10%椰汁處理差異不顯著，但明顯高于對照。

注：A，從左到右分別為培養(yǎng)3個月后瓊脂濃度0.5%、0.6%、0.7%和0.8%培養(yǎng)基中的幼苗；B，從左到右分別為培養(yǎng)3個月后蔗糖濃度1%、2%、3%、4%培養(yǎng)基中的幼苗；C，從左到右分別為培養(yǎng)3個月后椰汁濃度20%、10%和0培養(yǎng)基中的幼苗。

Note: A，Seedling after 3-month culture on 0.5%，0.6%，0.7% and 0.8% agar culture medium from left to right; B，Seedling after 3-month culture on solid culture medium with sucrose concentration of 1%，2%，3% and 4% from left to right; C，Seedling after 3-month culture on solid culture medium with coconut juice concentration of 20%，10% and 0 from left to right.

圖2不同培養(yǎng)條件金釵石斛幼苗的生長狀況

Fig.2 Growth status ofD.nobileseedlings with different culture conditions

表3 不同培養(yǎng)條件金釵石斛幼苗的生長

2.3 激素和活性炭對幼苗生根的影響

由表4看出，培養(yǎng)基是添加NAA、IBA和活性炭均能夠顯著促進金釵石斛幼苗根的生長。

2.3.1 激素隨著NAA和IBA濃度升高，根的生長更加旺盛，生根數和根長均呈增加趨勢。NAA濃度為1 mg/L時，生根數和根長、根粗均達最大值，分別為5.25條、7.19 cm和0.084 cm，其中，生根數和根長顯著高于無添加和0.2 mg/L處理。IBA濃度為1 mg/L時，生根數和根長、根粗均達最大值，分別為6.13條、5.41 cm和0.086 cm，但與0、0.2 mg/L和0.5 mg/L處理差異不顯著，僅與無添加處理差異顯著。NAA與IBA相比較而言，NAA更有利于根長的生長，而IBA更有利于生根數的增加。

表4不同激素和活性炭處理金釵石斛幼苗根的生長

Table 4 Growth ofD.nobileseedling root protocorm treated with different hormone and active carbon

處理濃度Concentration生根數/條Rooting number根長/cmRoot length根粗/cmRoot diameterNAA CK13.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 bN13.75±0.41 b3.53±0.30 b0.085±0.003 aN24.25±0.37 ab6.71±0.44 a0.079±0.004 abN35.25±0.41 a7.19±1.17 a0.084±0.002 aIBA CK23.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 bT14.50±0.57 ab4.74±0.62 a0.078±0.004 abT25.38±0.71 a4.64±0.47 a0.082±0.005 abT36.13±0.90 a5.41±0.50 a0.086±0.006 aACCK33.13±0.44 b2.67±0.39 b0.070±0.003 cA14.00±0.33 ab3.16±0.35 c0.068±0.004 cA24.50±0.33 a4.15±0.67 bc0.076±0.003 cA34.88±0.55 a5.19±0.51 ab0.099±0.004 bA45.25±0.31 a6.25±0.52 a0.112±0.005 a

2.3.2 活性炭隨著活性炭濃度升高，根的生長更加旺盛，生根數、根長和根粗均呈增加趨勢。當活性炭濃度為2 g/L時，培養(yǎng)基透明度最低，生根數、根長和根粗達最大，分別為5.25條、6.25 cm和0.112 cm，生根數顯著高于無添加處理，根長顯著高于除1 g/L處理的其余處理，根粗顯著高于其余處理。說明，活性炭濃度越高，越有利于生根。

3 結論與討論

瓊脂的凝固能力與原料、生產廠家的加工方式、高壓滅菌的溫度、時間及pH等因素有關。瓊脂本身不提供任何營養(yǎng)而只起支持作用[9]。瓊脂濃度太低，不能很好地起支持作用，但如果濃度太高則硬化，植株不能與培養(yǎng)基很好地接觸，營養(yǎng)物質難以擴散被植株吸收。一般來說，瓊脂含量為0.3%～0.5%時形成半固體，即較軟的固體，含量在0.7%以上形成較硬的固體。該試驗發(fā)現，在較軟的培養(yǎng)基上培養(yǎng)石斛蘭生長旺盛。

糖作為碳源，為細胞提供合成新化合物的骨架，并為其呼吸代謝提供底物和能源，還可以維持滲透壓。蘭花的組織培養(yǎng)普遍使用蔗糖作為碳源。該研究表明，低濃度蔗糖作為碳源，可致石斛幼苗發(fā)生玻璃化現象，而高濃度雖然有利于根的生長，但葉片生長受到一定抑制。可能是因為過低的糖不能滿足細胞營養(yǎng)、代謝和生長的需要，過高的糖又可能會干擾正常糖代謝，使培養(yǎng)系統(tǒng)滲透壓增加，阻礙了細胞對水分的吸收，明顯抑制地上部分的生長。綜合考慮莖、葉和根的生長認為，金釵石斛幼苗培養(yǎng)最佳蔗糖濃度為3%。

天然提取物是除基礎培養(yǎng)基中已加入的有機質外額外添加的一些有機物，在石斛繁殖研究中常用椰汁、香蕉汁和馬鈴薯勻漿等作為天然提取物來源[10-11]。椰汁養(yǎng)分豐富且復雜，含有玉米素等植物激素，還具有緩沖培養(yǎng)基pH的功能。該試驗采用椰汁為添加物顯著促進了金釵石斛幼苗的生長，說明，椰汁對石斛的生長十分有利。

趙天榜等[12-13]研究發(fā)現，激素NAA和IBA對植物根再生誘導效果顯著。該研究表明，NAA和IBA對石斛幼苗生根有促進作用，且濃度越高促進效果越明顯，二者均以濃度為1 mg/L時生根數和根長最大。

活性炭常用于植物組織培養(yǎng)中促進細胞生長和發(fā)育?；钚蕴?AC)的作用可能在于可以不可逆的吸附培養(yǎng)基中一些抑制性化合物，降解一些有毒代謝物，如酚類化合物和褐化物質[14]。單獨的AC或聯合生長素可以促進很多組培植物生根[15]。該研究表明，添加AC有助于石斛幼苗生根。關于AC促進根生長的機理并不十分清楚，一般認為與AC減弱光照有關。由此推測，可能是由于根頂端能產生IAA，促進了根的生長，但IAA易受可見光的光氧化而被破壞，因此，AC的主要作用可能在于通過減弱光照保護IAA，從而間接促進根的生長。