應(yīng)用GeneXpert法檢測(cè)沈陽(yáng)地區(qū)某醫(yī)院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的研究

侯博研 張智潔 周秀珍 王虹 陳愉中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 0004；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 0004；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第七臨床學(xué)院 遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)撫礦總醫(yī)院呼吸科，撫順 000

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，KP)屬革蘭陰性桿菌，是一種條件致病菌，常存在于人體上呼吸道和腸道。肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染率近期逐年增高，已成為醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一[1-2]。碳青霉烯類抗菌藥物是針對(duì)革蘭陰性菌的廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，曾被認(rèn)為是自20世紀(jì)80年代來(lái)對(duì)抗多藥耐藥革蘭陰性菌的最后一道防線。隨著臨床廣譜抗菌藥物的過(guò)度應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌(Carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP)的出現(xiàn)，導(dǎo)致臨床幾近無(wú)藥可用，患者治療費(fèi)用增加，病死率增加，給臨床抗感染治療提出了巨大困難和挑戰(zhàn)[3-5]。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的機(jī)制中關(guān)注度最高的因素為攜帶產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥基因。本研究對(duì)北方地區(qū)CRKP對(duì)常見抗菌藥物的耐藥性及5種耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2013年1月至2017年6月盛京醫(yī)院微生物室從不同病區(qū)各種臨床標(biāo)本培養(yǎng)出的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌60株，標(biāo)本類型包括：血液痰、尿液、導(dǎo)管末端、穿刺液、胸水等。剔除同一患者重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 試劑和儀器 腸桿菌科藥敏板卡；美羅培南、亞胺培南、厄他培南藥敏紙片(溫州市康泰生物科技有限公司)；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(梅里埃生物制品有限公司)；MH平板(梅里埃生物制品有限公司)；Xpert Carba-R試劑盒(GXCARBARCE-10美國(guó)賽佩公司)；Vitek 2細(xì)菌全自動(dòng)鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；Gene-Xpert XVI-4-2檢測(cè)儀(808400美國(guó)賽佩公司)；生物安全柜(海爾公司)；細(xì)菌培養(yǎng)箱(Thermo公司)；比濁儀(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 VITEK 2 Compact法細(xì)菌鑒定和藥敏分析

(1)菌株復(fù)蘇：三區(qū)劃線法將保存菌株在血平板上，細(xì)菌培養(yǎng)箱35℃孵育16～24 h；(2)在載卡架上放試管，每管中加入3 ml NaCl溶液；(3)配制比濁濃度0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?(4)取145μl上述菌懸液與3 ml 0.45%NaCl混合，震蕩混勻；(5)將藥敏板卡放在卡架上，卡片輸樣管插入到菌懸液中，啟動(dòng)檢測(cè)；(6)讀取結(jié)果。

1.3.2 擴(kuò)散法(Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法)藥敏實(shí)驗(yàn) (1)菌株復(fù)蘇(同上)；(2)配制比濁濃度0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?3)用無(wú)菌棉簽蘸取菌液，擠壓去除多余菌液后均勻涂抹于MH培養(yǎng)基上，切換角度分別涂抹3次，最后沿培養(yǎng)基內(nèi)緣均勻涂抹一周并蓋上蓋子；(4)置室溫干燥3～5 min后用鑷子將藥敏拭子貼于培養(yǎng)基面上；(5)培養(yǎng)箱孵育18～24 h；(6)量取抑菌環(huán)直徑，判讀結(jié)果。

1.3.3 GeneXpert法檢測(cè)耐藥基因 (1)菌株復(fù)蘇(同上)；(2)在載卡架上放一次性塑料試管，每管中加入3 ml生理鹽水；(3)配制比濁濃度0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?4)吸取10μl至樣本處理液，漩渦震蕩10 s；(5)吸取約1.7 ml混合液加入試劑盒內(nèi)，蓋上試劑盒蓋子啟動(dòng)檢測(cè)；(6)判讀結(jié)果。

1.4 判定及排除標(biāo)準(zhǔn) (1)耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌判定標(biāo)準(zhǔn)[6]：根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2016年版標(biāo)準(zhǔn)(CLSIMl00-S26)，抑菌圈直徑：厄他培南≤18 mm、亞胺培南和美羅培南≤19 mm判斷為耐藥或VITEK-2藥敏顯示這三種抗生素中介、耐藥，需進(jìn)行手工法確認(rèn)。對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南中至少一種耐藥的菌株為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：剔除重復(fù)標(biāo)本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌對(duì)常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果 我院分離的60株CRKP對(duì)常用的16種抗生素藥敏結(jié)果顯示(表1)：阿米卡星敏感度最高達(dá)78.95%；左氧氟沙星及環(huán)丙沙星敏感率分別為48.28%和43.10%；氨基糖苷類中的慶大霉素和妥布霉素、磺胺類中的復(fù)方新諾明敏感率分別37.93%、35.71%及29.31%；呋喃妥因敏感率為5.26%，中介率為28.95%；青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢類以及其他β-內(nèi)酰胺類中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、氨芐西林/舒巴坦敏感率0%～15.52%。

表1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌對(duì)常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.2 CRKP耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 收集我院60株CRKP應(yīng)用GeneXpert方法檢測(cè)5種耐藥基因結(jié)果顯示(表2、3)：攜帶碳青霉烯酶49株，占81.67%；其中，攜帶KPC酶30株，占50%；攜帶NDM酶28株，占46.67%；攜帶IMP-1酶3株，占5%；未攜帶碳青霉烯酶11株，占18.33%。攜帶單一KPC酶19株，占31.7%；攜帶單一NDM酶18株，占30%；攜帶單一IMP-1酶1株，占1.7%；同時(shí)攜帶KPC和NDM酶9株，占15%；同時(shí)攜帶KPC和IMP-1酶1株，占1.7%；同時(shí)攜帶IMP-1、KPC和NDM酶1株，占1.7%；其余型耐藥基因未檢出。

2.3 是否檢出耐藥基因與亞胺培南藥物最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)分析結(jié)果 亞胺培南藥物敏感性MIC值與是否檢出耐藥基因差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)，檢出耐藥基因菌株對(duì)亞胺培南耐藥更嚴(yán)重。

2.4 檢出耐藥基因數(shù)與患者預(yù)后分析結(jié)果 檢出耐藥基因數(shù)量與患者預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)，未檢出耐藥基因臨床菌株、檢出1種耐藥基因臨床菌株及檢出2種及以上耐藥基因臨床菌株對(duì)患者病情好轉(zhuǎn)及痊愈或死亡及病情加重退院差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 60株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌菌株各耐藥基因檢出數(shù)量

表3 60株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯桿菌菌株耐藥基因檢出情況

表4 是否檢出耐藥基因與亞胺培南藥物敏感性MIC值分析

表5 檢出耐藥基因情況與患者預(yù)后分析(株)

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物在國(guó)內(nèi)外均有廣泛應(yīng)用，常用的碳青霉烯類包括有：亞胺培南(泰能)、厄他培南(怡萬(wàn)之)、美羅培南(美平)、比阿培南等。CRKP由Mack-enzie等于1997年在美國(guó)北卡羅萊納州首次發(fā)現(xiàn)，此菌能夠水解并產(chǎn)生碳青霉烯酶[7]。之后陸續(xù)在國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)報(bào)道，并且大多數(shù)表現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。近年耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的檢出率呈逐年升高趨勢(shì)，Marsik和Nambiar[8]報(bào)道，CRE分離率2008年為0.6%，2016年上升至6.4%。

本研究中，該菌對(duì)抗感染治療常用的16種抗生素中氨基糖苷類中的阿米卡星敏感性最高達(dá)78.95%，臨床可選擇作為治療藥物，但單藥治療常難以控制感染。喹諾酮類中左氧氟沙星及環(huán)丙沙星敏感率分別為48.28%和43.10%，也可作為僅次于阿米卡星用于控制該菌感染的第二選擇。氨基糖苷類中的慶大霉素和妥布霉素、磺胺類中的復(fù)方新諾明敏感率分別37.93%、35.71%及29.31%，不適合用于控制沈陽(yáng)地區(qū)CRKP的感染。呋喃妥因敏感率為5.26%，中介率為28.95%，亦不適合用于控制該菌的感染。青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢類以及其他β-內(nèi)酰胺類中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、氨芐西林/舒巴坦敏感率在0%～15.52%。在臨床治療中，應(yīng)根據(jù)抗菌譜、抗生素的效能及藥敏結(jié)果，遵循耐藥率由低到高的原則選擇耐藥率小于30%的抗菌藥物以降低耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)?？梢钥闯觯以悍蛛x出CRKP菌株對(duì)常見抗菌藥物的耐藥情況不容樂(lè)觀，β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療腸桿菌科細(xì)菌感染的有效抗菌藥物，但隨著產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌廣泛出現(xiàn)，此類抗菌藥物的抗感染治療作用明顯下降。并且，研究發(fā)現(xiàn)某些種類的β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)腸桿菌科細(xì)菌存在接種效應(yīng)。接種效應(yīng)是指在細(xì)菌的接種濃度增高100倍時(shí)，抗菌藥物的最低MIC值至少升高8倍的現(xiàn)象，這種程度不同的接種效應(yīng)導(dǎo)致很多β-內(nèi)酰胺類藥物即使體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果敏感也不推薦于臨床應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，部分感染致病菌不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥率高，而且呈現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，有少部分CRKP菌株對(duì)阿米卡星、喹諾酮類敏感，這些藥物可以聯(lián)合應(yīng)用治療CRKP[9]。研究顯示，多黏菌素對(duì)耐碳青霉烯類腸桿菌CRE有相對(duì)較好的體外抗菌活性，可選擇作為治療藥物[9-10]。早期文獻(xiàn)報(bào)道多黏菌素可產(chǎn)生腎毒性及神經(jīng)毒性，曾因此在國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用逐漸減少。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)多黏菌素進(jìn)行了更深入的研究，之前的報(bào)道中由于研究對(duì)象差異大、缺少對(duì)照研究、給藥量不同等而對(duì)多黏菌素不良反應(yīng)的估計(jì)存在一定程度的夸大，并且多藥耐藥的革蘭陰性桿菌的迅速增多并且常導(dǎo)致嚴(yán)重感染，使黏菌素再次受到關(guān)注。替加環(huán)素對(duì)多重耐藥的革蘭陰性桿菌抗菌效果好，是目前為數(shù)不多對(duì)CRE有抗菌作用的高效的廣譜抗菌藥物之一[11]。聯(lián)合用藥能提高治療效果并有利于預(yù)防細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

雖然腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制多為攜帶產(chǎn)酶耐藥基因，但耐藥基因的流行和分布情況在不同種屬細(xì)菌中存在差異。Ambler分類法根據(jù)氨基酸序列的相似性把β-內(nèi)酰胺酶分為4類(A、B、C、D)，其中A類、B類、D類中存在能水解碳青霉烯類的酶，因此被稱為碳青霉烯酶[12-13]。A類中最具有代表意義的酶型是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)，也是最具有臨床意義的酶型，屬于典型的非金屬碳青霉烯酶。早年攜帶KPC酶耐藥基因是肺炎克雷伯桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最常見的機(jī)制。KPC耐藥基因可經(jīng)整合子、質(zhì)粒與插入序列基因原件進(jìn)行傳播，存在局部爆發(fā)的潛在威脅[14]。澳大利亞2012年報(bào)道了第1例臨床分離產(chǎn)KPC酶KP，該患者感染前曾去過(guò)希臘[15]。法國(guó)Meaux醫(yī)療中心曾報(bào)道過(guò)產(chǎn)KPC酶在KP中出現(xiàn)小范圍的流行，經(jīng)MLST分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為ST512型，之后證實(shí)與一例意大利感染患者有關(guān)[16]。之后診斷這類細(xì)菌感染的患者中也多有在其他國(guó)家旅行的經(jīng)歷[17]。攜帶KPC耐藥基因的KP與感染患者在不同國(guó)家之間的旅行傳播有密切關(guān)系。我國(guó)于2007年初次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC酶的KP[18]。B類碳青霉烯酶比較常見的酶型有IPM型及VIM型。近年報(bào)道新發(fā)現(xiàn)的新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)也屬于B類酶。2007年末印度籍瑞典男性在新德里地區(qū)某醫(yī)院手術(shù)后并發(fā)感染，于2008年初回到瑞典。該患者在住院期間，分別注射了加替沙星、阿莫西林克拉維酸、阿米卡星、甲硝唑等藥物。2008年1月，在該患者尿液中分離到的KP進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，此株細(xì)菌對(duì)絕大多數(shù)抗生素耐藥。經(jīng)英國(guó)Cardiff大學(xué)的Timothy R Walsh教授團(tuán)隊(duì)分析，是一種金屬β-內(nèi)酰胺酶，被命名為NDM-1型[19]。NDM-1酶對(duì)碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗生素有耐藥性。目前，攜帶NDM耐藥基因菌的感染已經(jīng)從印度、巴基斯坦等國(guó)家傳播到英國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、加拿大、西班牙、比利時(shí)、日本、荷蘭國(guó)家[20-23]。D類碳青霉烯酶一般在腸桿菌科細(xì)菌中較少見。KPC型碳青霉烯酶是導(dǎo)致腸桿菌出現(xiàn)耐藥性的關(guān)鍵，其原因可能是頭孢菌素酶的表達(dá)強(qiáng)度過(guò)大，造成其與外膜孔蛋白的合并發(fā)生丟失，因此大大降低了碳青霉烯類抗生素與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合能力，使得碳青霉烯類抗菌素水解而產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，最終導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生[24]。產(chǎn)NDM菌一半以上分離自印度，可通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌間自由移動(dòng)、復(fù)制和傳播，可在細(xì)菌之間傳遞，近幾年在我國(guó)呈逐年增多趨勢(shì)，散發(fā)分布且波及菌種較多，主要在華東地區(qū)報(bào)道較多，已報(bào)道的有大腸埃希菌、克雷伯菌屬、不動(dòng)桿菌屬等[25]。上海一項(xiàng)研究報(bào)道，2010～2013年從上海新華醫(yī)院臨床樣本中分離到CRKP77株，其中69株攜帶KPC基因，占90%。經(jīng)測(cè)序?yàn)镵PC-2基因，這些菌株可能通過(guò)患者院內(nèi)轉(zhuǎn)科形成播散[26]。廣州市一項(xiàng)研究報(bào)道，南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州軍區(qū)廣州總醫(yī)院分離2015年26株CRKP，經(jīng)PCR檢測(cè)結(jié)果25株攜帶KPC酶，1株攜帶IMP酶，未檢測(cè)出OXA-48、VIM、NDM酶[27]。

本研究中顯示，沈陽(yáng)地區(qū)60株CRKP攜帶碳青霉烯酶49株；以攜帶KPC及NDM酶型為主，偶見攜帶IMP-1酶型，其余耐藥基因型未檢出。本次實(shí)驗(yàn)檢出耐藥基因型與我國(guó)南方地區(qū)報(bào)道存在差異，可能存在地域差異導(dǎo)致耐藥基因檢出不同以及隨時(shí)間推移耐藥基因型別分布發(fā)生變化等。關(guān)于兩種或兩種以上碳青霉烯酶在同一菌株中分離的報(bào)道也越來(lái)越多。2012年印度首次分離到一株同時(shí)攜帶KPC和NDM基因的KP[28]。KP中發(fā)現(xiàn)的耐藥基因類型也逐年增多，這些耐藥基因主要存在細(xì)菌的質(zhì)粒中，通過(guò)細(xì)菌與細(xì)菌之間的傳播進(jìn)而導(dǎo)致醫(yī)院感染及流行。此次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)常見五種基因型(KPC、NDM、IMP-1、OXA-48、VIM)，這樣無(wú)法排除是否存在其他類型耐藥基因，并且未檢出耐藥基因的CRKP菌株可能存在例如外排泵等其他的耐藥機(jī)制。Tzouvelekis等[29]研究報(bào)道在15項(xiàng)研究中50例碳青霉烯類單藥治療的CRE感染，碳青霉烯類藥物MIC＞8 mg/L時(shí)碳青霉烯類治療失敗率高達(dá)75%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檢出耐藥基因臨床菌株對(duì)亞胺培南藥物敏感性MIC≥16 mg/L與未檢出耐藥基因臨床菌株差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。懷疑細(xì)菌感染的患者，應(yīng)盡早留取標(biāo)本行藥物敏感性及耐藥基因檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的GeneXpert儀器是全自動(dòng)一體化的半巢式熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將PCR樣品制備和檢測(cè)程序設(shè)定于一體，對(duì)樣品完全自動(dòng)化地進(jìn)行核酸提取、純化、擴(kuò)增與檢測(cè)，應(yīng)用即時(shí)的光學(xué)檢測(cè)軟件，一旦發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因便可以得出結(jié)果，極大地減少了檢測(cè)所需時(shí)間。GeneXpert系統(tǒng)全程檢測(cè)均在封閉試劑盒中全自動(dòng)進(jìn)行，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。從患者標(biāo)本采集至送檢及結(jié)果回報(bào)可在2 h內(nèi)完成，可以及時(shí)指導(dǎo)臨床醫(yī)生調(diào)整治療方案降低治療失敗率。本研究通過(guò)收集臨床資料分析，檢出耐藥基因數(shù)量與患者預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果可能與患者存在其他基礎(chǔ)疾病等影響因素、藥物敏感性結(jié)果回報(bào)時(shí)間、臨床抗菌藥物應(yīng)用及機(jī)體的差異性有關(guān)。據(jù)報(bào)道，感染CRE的患者或CRE無(wú)癥狀攜帶者有有可能成為感染源[30]。產(chǎn)NDM酶細(xì)菌可能主要會(huì)從危重患者、插管和機(jī)械通氣患者和老年人等易感人群身上分離出來(lái)，甚至引起院內(nèi)傳播[31]。加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生、遵守操作規(guī)范、加強(qiáng)消毒隔離措施，減少院內(nèi)感染的發(fā)生，爭(zhēng)取做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療。同時(shí)開展相關(guān)調(diào)查研究，及時(shí)了解這類菌株耐藥現(xiàn)狀、流行趨勢(shì)及特點(diǎn)。CRKP已經(jīng)引起世界范圍關(guān)注，所以實(shí)驗(yàn)室及臨床上應(yīng)給予此類細(xì)菌監(jiān)測(cè)足夠的重視，以防CRKP耐藥菌株暴發(fā)流行。