2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑的合成及抑菌活性研究

王德志,馮吉利,陳淑偉,麻妙鋒

(1.西北農(nóng)林科技大學 化學與藥學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

1,3,4-噻二唑是含有“-N=C=S”結構骨架的五元雜環(huán)化合物(圖1)，其衍生物良好的理化性質(zhì)和高效低毒的生物活性被廣泛地應用于農(nóng)藥和醫(yī)藥領域[1-8]。早在20世紀70年代日本武田制藥公司(Takeda)就發(fā)現(xiàn)，2-氨基-1,3,4-噻二唑 (敵枯唑，ATDA，圖1) 對由黃單孢桿菌引起的植物病害有很好的防治效果。中國自主研制的殺菌劑2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑銅 (噻菌銅，thiodiazole-copper，圖1) 以其低毒廣譜的特性，被廣泛應用于糧食作物、果蔬等細菌性病害的防治[9-11]。目前，以 l,3,4-噻二唑基團作為基本活性結構骨架，通過在2-位或5-位引入其他活性基團，期望實現(xiàn)2個活性分子的活性疊加和優(yōu)化。這種活性基團拼接法對噻二唑類化合物的開發(fā)和應用以及新型藥物的合成都具有一定的指導意義，文獻關于含有砜、亞砜、硫醚、磺胺等含硫基團以及噁二唑等雜環(huán)的 l,3,4-噻二唑類衍生物的生物活性報道較多，而含氟原子及其他芳香雜環(huán)的生物活性尤其是農(nóng)用抑菌活性的文獻相對較少[12-15]。為了擴展1,3,4-噻二唑類衍生物的抑菌譜，本文利用芳香醛和氨基硫脲為起始原料進行反應，在5-位引入具有代表性的含氟、呋喃和噻吩基團的2-氨基-1,3,4-噻二唑類衍生物，并以5種重要的植物病原真菌為靶標對目標化合物進行抑菌活性的初步研究，希望通過改變5-位基團的類型，篩選出具有更廣譜和更高抑菌活性的化合物。

圖1 1,3,4-噻二唑結構及含有此結構單元的藥用化合物Fig.1 Structural unit of 1,3,4-thiadiazole and pharmacologically compounds containing 1,3,4-thiadiazole units

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker Avance 型核磁共振譜儀 (TMS 為內(nèi)標，1H NMR 為 500 MHz、13C NMR 為 125 MHz，美國 Bruker 公司生產(chǎn))；SGW○RX-4B 型顯微熔點儀；Thermo LCQ Fleet 型電噴霧電離低分辨質(zhì)譜儀(LC-ESI-MS)。

材料與試劑：GF254型薄層層析硅膠、200～300 目柱層析硅膠均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；所用試劑苯甲醛、鄰氟苯甲醛、對氟苯甲醛、間氟苯甲醛、2-呋喃甲醛、2-噻吩甲醛、氨基硫脲，一水合檸檬酸，二水合檸檬酸鈉，六水合三氯化鐵等均為 AR 級國產(chǎn)試劑，使用前經(jīng)常規(guī)處理。

1.2 供試病原真菌與培養(yǎng)基

供試病原真菌：馬鈴薯干腐病菌 (Fusariumcoeruleum)、小麥赤霉病菌 (Fusariumgraminearum)、番茄灰霉病菌 (Botrytiscinerea)、白菜黑斑病菌 (Alternariabrassicae)、煙草赤星病菌 (Alternariaalternate)。

培養(yǎng)基及其配制：選用 PDA 培養(yǎng)基。其配方為：去皮馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL。配制時取 200 g 去皮馬鈴薯，切碎煮沸 20 min，趁熱過濾后取濾液，加入其余組分定容至 1 000 mL，pH 為自然狀態(tài)，121 ℃高溫滅菌 20 min。

1.3 目標化合物合成路線

目標化合物的合成如圖 2 所示。

圖2 2-氨基-5芳基-1,3,4-噻二唑類化合物的合成路線Fig.2 Synthetic route of 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazole derivatives

1.4 目標化合物合成步驟

1.4.1 中間體芳醛縮氨基硫脲(A1-A6)的合成 將氨基硫脲(25 mmol，2.28 g)加入到 40 mL 的蒸餾水中，加熱至全溶，然后加入苯甲醛(25 mmol，2.7 mL)的乙醇溶液(40 mL)，65 ℃ 攪拌回流反應 1 h，待反應完全后，靜置冷卻至室溫直至白色晶體析出完全，抽濾。粗產(chǎn)物用 160 mLφ= 70% 乙醇溶液重結晶，得白色針狀晶體苯甲醛縮氨基硫脲(A1)，產(chǎn)率 95 %[16-17]。

A2-A6 的試驗步驟與 A1 完全相同，產(chǎn)率 78%～92%。

1.4.2 目標化合物 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑(B1-B6)的合成 將苯甲醛縮氨基硫脲(20 mmol，3.58 g)和 FeCl3· 6H2O(60 mmol，16.2 g)依次加入到 200 mL 蒸餾水中，然后再加入一水合檸檬酸(44 mmol，9.24 g)，二水合檸檬酸鈉 (20 mmol，5.88 g)，加熱攪拌全溶后于 80 ℃ 繼續(xù)回流 45 min 至反應完全。將反應液冷卻至室溫，用φ=10% 的氨水中和至完全生成沉淀，抽濾。粗產(chǎn)物用φ= 75 % 乙醇重結晶得白色固體 2-氨基-5-苯基-1,3,4-噻二唑(B1)。產(chǎn)率 78%[16-17]。

B2-B6 的試驗步驟與 B1 完全相同，產(chǎn)率 65%～72%。

1.5 目標化合物抑菌活性測定

采用生長速率法[18-19]測定目標化合物 B1-B6 對 5 種供試植物病原真菌的抑菌活性。首先將目標化合物配制成質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1帶藥 PDA 培養(yǎng)基，然后倒入高溫滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，接種供試菌餅 (直徑 5 mm)，每個處理設 3 個重復，25 ℃ 培養(yǎng) 3 d，用十字交叉法量取菌落擴展直徑，計算抑制率。試驗以噻菌靈為陽性對照，二甲亞砜為陰性對照。

抑制率 =(陰性對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/ 陰性對照組菌落直徑×100%

對抑菌活性較好的化合物進行抑菌作用的毒力測定，設置質(zhì)量濃度梯度為：100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1。以目標化合物質(zhì)量濃度常用對數(shù)為橫坐標 (x)，抑制率的機率值為縱坐標(y)，利用 SPSS 19.0 軟件分析數(shù)據(jù)求得毒力回歸方程和有效中濃EC50值。

2 結果與分析

2.1 化合物的合成與結構表征

首先利用芳香醛與氨基硫脲反應生成芳香醛縮氨基硫脲，再以FeCl3為氧化劑，在φ= 50% 乙醇水溶液中進行氧化成環(huán)。反應過程中加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，使得反應條件溫和，時間較短。最后滴加氨水調(diào)節(jié)溶液pH促使產(chǎn)物沉淀完全，提高產(chǎn)率。對化合物 A1-A6和B1-B6 分別進行1H NMR與13C NMR分析，證明產(chǎn)物的化學結構，結果如下：

A1：苯甲醛縮氨基硫脲，白色固體，產(chǎn)率 95%，熔點(mp)160～161 ℃。1H NMR (CD3OD)δ8.00 (s,1H,CH=N)，7.76～7.75 (m,2H,ArH)，7.42～7.41 (m,3H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.6 (C=S)，143.9 (CH=N)，134.0 (ArC)，129.9 (ArC)，128.4 (ArC)，127.1 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值180.00 [M+1]+，理論值 179.05 [M]+。

A2：2-氟苯甲醛縮氨基硫脲，白色固體，產(chǎn)率 92%，mp 179～180 ℃。1H NMR (CD3OD)δ8.25 (s,1H,CH=N)，8.07 (t,J=7.3 Hz,1H,ArH)，7.44～7.43 (m,1H,ArH)，7.23 (t,J=7.4 Hz,1H,ArH)，7.16 (t,J=9.5 Hz,1H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.9 (C=S)，161.6 (d,J=250.9 Hz,ArC)，136.4 (d,J=5.3 Hz,CH=N)，131.6 (d,J=8.4 Hz,ArC)，126.4 (d,J=2.3 Hz,ArC)，124.3 (d,J=3.5 Hz,ArC)，121.7 (d,J=9.8 Hz,ArC)，115.4 (d,J=21.2 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值 198.06 [M+1]+，理論值 197.04 [M]+。

A3：3-氟苯甲醛縮氨基硫脲，白色固體，產(chǎn)率 90%，mp 191～192 ℃。1H NMR (CD3OD)δ7.98 (s,1H,CH=N)，7.60 (d,J=9.9 Hz,1H,ArH)，7.52～7.51 (m,1H,ArH)，7.46～7.41 (m,1H,ArH)，7.15 (t,J=8.3 Hz,1H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.9 (C=S)，163.1 (d,J=244.9 Hz,ArC)，142.2 (d,J=2.8 Hz,CH=N)，136.6 (d,J=8.0 Hz,ArC)，130.2 (d,J=8.2 Hz,ArC)，123.5 (d,J=2.6 Hz,ArC)，116.5 (d,J=21.9 Hz,ArC)，112.7 (d,J=23.1 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值198.05 [M+1]+，理論值197.04 [M]+。

A4：4-氟苯甲醛縮氨基硫脲，白色固體，產(chǎn)率 90%，mp 192～194 ℃。1H NMR (CD3OD)δ7.99 (s,1H,CH=N)，7.80 (t,J=7.0 Hz,1H,ArH)，7.16 (t,J=8.3 Hz,1H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.6 (C=S)，163.9 (d,J=249.2 Hz,ArC)，142.6 (CH=N)，130.5 (d,J=2.9 Hz,ArC)，129.2 (d,J=8.5 Hz,ArC)，115.4 (d,J=22.3 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值198.00 [M+1]+，理論值197.04 [M]+。

A5：2-呋喃甲醛縮氨基硫脲，淡棕色，產(chǎn)率 80%，mp 152～153 ℃。1H NMR (CD3OD)δ7.89 (s,1H,CH=N)，7.66 (s,1H,ArH)，6.87 (s,1H,ArH)，6.58 (s,1H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.5 (C=S)，149.5 (CH=N)，144.7 (ArC)，133.3 (ArC)，113.1 (ArC)，111.7 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值170.00 [M+1]+，理論值 169.03 [M]+。

A6：2-噻吩甲醛縮氨基硫脲，米黃色，產(chǎn)率 78%，mp 189～191 ℃。1H NMR (CD3OD)δ8.18 (s,1H,CH=N)，7.53 (s,1H,ArH)，7.38 (s,1H,ArH)，7.11 (s,1H,ArH)；13C NMR (CD3OD)δ178.2 (C=S)，156.5 (CH=N)，138.6 (ArC)，130.5 (ArC)，128.3 (ArC)，127.3 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值185.97 [M+1]+，理論值 185.01 [M]+。

B1：2-氨基-5-苯基-1,3,4-噻二唑，白色固體，產(chǎn)率 78%，mp 225～227 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ7.76 (d,J=7.1 Hz,2H,ArH)，7.49～ 7.43 (m,3H,ArH)，7.41 (s,2H,NH2)；13C NMR (DMSO-d6)δ169.0 (C=N)，156.9 (C=N)，131.5 (ArC)，130.0 (ArC)，129.6 (ArC)，126.8 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值 178.11 [M+1]+，理論值 177.04 [M]+。

B2：2-氨基-5-(2-氟苯基)-1,3,4-噻二唑，白色固體，產(chǎn)率 75%，mp 226～228 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ8.11～8.08 (m,1H,ArH)，7.53～7.49 (m,1H,ArH)，7.46 (s,2H,NH2)， 7.40～7.33 (m,2H,ArH)；13C NMR (DMSO-d6)δ170.4 (d,J=4.1 Hz,C=N)，158.4 (d,J=248.4 Hz,ArC)，148.9 (d,J=7.8 Hz,C=N)，131.8 (d,J=8.6 Hz,ArC)，128.2 (d,J=2.4 Hz,ArC)，125.6 (d,J=2.9 Hz,ArC)， 119.2 (d,J=12.2 Hz,ArC)，116.8 (d,J=21.7 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值 196.00 [M+1]+，理論值195.03 [M]+。

B3：2-氨基-5-(3-氟苯基)-1,3,4-噻二唑，白色固體，產(chǎn)率 72%，mp 229～231 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ7.61～7.58 (m,2H,ArH)，7.54～7.51 (m,3H,ArH,NH2)，7.29～7.27 (m,2H,ArH)；13C NMR (DMSO-d6)δ169.5 (C=N)，162.8 (d,J=244.3 Hz,ArC)，155.5 (C=N)，133.7 (d,J=8.6 Hz,ArC)，131.8 (d,J=8.4 Hz,ArC)，123.1 (d,J=2.5 Hz,ArC)， 116.8 (d,J=21.1 Hz,ArC)，113.0 (d,J=23.6 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值196.04 [M+1]+，理論值195.03 [M]+。

B4：2-氨基-5-(4-氟苯基)-1,3,4-噻二唑，白色固體，產(chǎn)率 75%，mp 244～245 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ7.81 (t,J=6.8 Hz,2H,ArH)，7.40 (s,2H,NH2)，7.31 (t,J=8.7 Hz,2H,ArH)；13C NMR (DMSO-d6)δ169.1 (C=N)，163.1 (d,J=246.9 Hz,ArC)，155.7 (C=N)，128.9 (d,J=8.6 Hz,ArC)，128.1 (d,J=3.1 Hz,ArC)，116.6 (d,J=22.2 Hz,ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值196.06 [M+1]+，理論值 195.03 [M]+。

B5：2-氨基-5-(2-呋喃)-1,3,4-噻二唑，淡黃色固體，產(chǎn)率 70%，mp 224～226 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ7.83 (s,1H,ArH)，7.42 (s,2H,NH2)，6.94 (s,1H,ArH)，6.66 (s,1H,ArH)；13C NMR (DMSO-d6)δ168.5 (C=N)，147.5 (C=N)，146.1 (ArC)，144.7 (ArC)，112.7 (ArC)，109.4 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值167.99 [M+1]+，理論值 167.02 [M]+。

B6：2-氨基-5-(2-噻吩)-1,3,4-噻二唑，淡棕色固體，產(chǎn)率 65%，mp 203～206 ℃。1H NMR (DMSO-d6)δ7.63 (d,J=4.5 Hz,1H,ArH)，7.40 (s,3H,ArH,NH2)，7.13 (s,1H,ArH)；13C NMR (DMSO-d6)δ168.6 (C=N)，151.1 (C=N)，133.8 (ArC)，128.4 (ArC)，128.05 (ArC)，128.02 (ArC)；LC-ESI-MS：m/z試驗值 184.03 [M+1]+，理論值 182.99 [M]+。

2.2 目標化合物的抑菌活性分析

在質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1時，目標化合物 B1-B6 對 5 種供試真菌馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、煙草赤星病菌的抑菌活性如表 1 所示。由表 1 可以看出，6 個化合物對5 種供試真菌均有一定的抑菌活性，且對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑菌活性要高于其他 3 種供試病原真菌，其中化合物 B4 對小麥赤霉病菌的抑菌率為85.7%，對番茄灰霉病菌的抑菌率為89.9%。但所有化合物的抑菌活性均遠低于商用殺菌劑噻菌靈。

表1 質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1 時目標化合物 B1-B6 對 5 種病原真菌菌落生長的抑制率Table 1 Preliminary inhibition rate of compounds B1-B6 against the tested five pathogenic fungi at 100 μg·mL-1 %

注：不同供試樣品對同一病原真菌間抑菌活性的顯著性差異用不同小寫字母表示 (P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between the inhibition of different compounds in the same tested fungus(P<0.05).

進一步對目標化合物的結構與抑菌活性相關性進行分析，當 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑的 5-位連接有苯基(B1)或氟取代苯基(B2-B4)時，化合物 B4 除對煙草赤星病菌的抑菌活性與化合物 B3 無顯著性差異外，其對其他 4 種供試病原真菌的抑菌活性均高于化合物 B1-B3，說明當苯環(huán)對位上連接有氟取代基時對化合物抑菌活性的影響高于鄰位和間位，這可能是由于對氟苯基的引入在一定程度上調(diào)節(jié)了分子原有骨架的物理或化學特性，以此提高了化合物的抑菌活性。當5-位連接有呋喃環(huán)(B5)或噻吩環(huán)(B6)時，化合物 B6 對5種供試病原真菌的抑菌活性均高于化合物 B5，說明噻吩環(huán)的引入對化合物抑菌活性的影響大于呋喃環(huán)，但明顯低于對氟苯基的影響。

由于目標化合物 B1-B4 對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑菌活性較好，本試驗進一步研究了4個化合物對這2種供試病原真菌抑菌活性的室內(nèi)毒力作用，結果見表2。

表2 目標化合物 B1-B4 對 2 種病原真菌的毒力測定結果Table 2 Toxicity activities of compounds B1-B4 against two phytopathogens

由表2可以看出，化合物 B4 對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌EC50值分別為23.17和 20.22 μg·mL-1，與化合物 B1-B3 的EC50值相比較，其毒力最強，對這2種病原真菌的抑菌效果最好。且化合物 B4 對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌毒力回歸方程的斜率最大，說明這2種病原真菌對化合物 B4 的反應靈敏度最高，即隨著試驗用藥濃度的增加，抑菌率明顯增大。

3 結論與討論

本研究基于 l,3,4-噻二唑活性結構骨架的特點，以芳香醛和氨基硫脲為原料，經(jīng)兩步合成路線對其 5-位進行結構修飾，合成了 6 個 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑類化合物，采用1H NMR 與13C NMR確定其結構。通過對化合物的離體抑菌試驗，表明 6 個化合物對 5 種供試病原真菌均具有一定的抑菌活性，且對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的抑菌活性要高于其他 3 種供試病原真菌。分析目標化合物的結構與活性相關性可知，當 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑的 5-位連接有對氟苯基時對化合物抑菌活性的貢獻優(yōu)于其他取代基，其對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的EC50值分別為 23.17 和 20.22 μg·mL-1。由于本試驗僅針對供試植物病原真菌進行了室內(nèi)離體抑菌活性的研究，并未進行盆栽和小區(qū)試驗，其田間抑菌試驗數(shù)據(jù)是否與室內(nèi)活性試驗測定結果一致，有待進一步驗證。此外，該化合物對供試的植物病原真菌的抑菌機理尚不清晰，尚需后期進行深入研究。