石柱參人參皂苷合成酶基因的克隆及表達(dá)量測定

王丹丹，冷春玲

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118003)

石柱參植物分類學(xué)上隸屬于五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)，以其干燥的根或根莖入藥；原產(chǎn)于遼寧省丹東市寬甸縣振江鄉(xiāng)石柱子村，以其蘆長、體靈、皮老紋深、須長須清、須有珍珠疙瘩、藥效高及形狀類似野山參等優(yōu)點而在國際中藥市場享有較高名譽[1]。

人參皂苷是石柱參的主要藥效成分，屬于三萜皂苷[2-6]，具有抗衰老、抗癌、抗炎癥、抗疲勞、治療心肌損傷、降血糖等作用。人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組成是評價人參藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，但其在石柱參中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，且人工合成尚未實現(xiàn)[7-11]。近年來，生物學(xué)專家對人參皂苷的體內(nèi)生物合成途徑進(jìn)行了大量研究，其中人參皂苷代謝途徑的分子機制研究進(jìn)展卓著，但對道地產(chǎn)區(qū)石柱參人參皂苷合成的分子機制研究還較少[12]。為探究石柱參人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的原因，本研究分別以5a生石柱參根、莖、葉組織為材料，測定石柱參6種人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Re 、Rg1、Rg2)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，及整個生長時期中人參皂苷合成酶基因鯊烯合成酶(SS)、細(xì)胞色素P450酶—CYP82D47、CYP716A42的表達(dá)量，并對人參皂苷合成酶基因(CYP82D47)進(jìn)行克隆，測序及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步分析人參皂苷合成酶基因表達(dá)量的動態(tài)變化與人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系，明確石柱參人參皂苷生物合成的分子生理機制，以期為石柱參栽培和人參藥材質(zhì)量的提高奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別以5 a生人參(對照組)、石柱參的根、莖、葉組織為試驗材料，2種試驗材料均于2017年5-9月采于丹東市寬甸滿族自治縣振江鎮(zhèn)大青村，每個生長時期均采集固定田壟的人參、石柱參各15株，采集后篩選出無病蟲害、個體差異小且生長勢良好的5株樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(表1)，樣本液氮冷凍于-80 ℃，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 稱取0.5 g 已干燥至恒質(zhì)量的各樣品粉末，過24目篩，加入250 mL甲醇，于55 ℃水浴恒溫回流提取1 h，過濾提取液，濾渣重復(fù)提取3次，用適量體積溶液洗滌殘渣，合并濾液，60 ℃減壓濃縮，定容至5 mL，用0.45 μm濾膜過濾，取濾液為供試品；采用Agilent 1200 Series高效液相色譜儀對人參、石柱參不同部位的6種人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Re、Rg1、Rg2)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定[13]，色譜柱為德國Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；乙腈-水溶液為流動相，梯度洗脫，流速1.5 mL/min；A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序： 0～16 min，56%B；16～20 min，56%→100% B； 20～40 min，100% B；40 min～47 min，56% B； 47～60 min，56% B；各組分均在70 min內(nèi)出完，柱溫 35 ℃，檢測波長203 nm；各樣本人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定重復(fù)4次，取平均值。

表1 石柱參樣品采集信息Table 1 Collection information of Shizhu ginseng samples

注：為方便后續(xù)試驗記錄，生長時期順序依次以字母A～K記錄。

Note:Each growth period was recorded as the alphabet A-K,just in order to facilitate follow-up test records.

1.2.2 總RNA提取 分別取人參與石柱參根、莖、葉組織于液氮中單獨研磨，按照Takara公司總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA，并檢測RNA完整性。并采用M-MuLV第1鏈cDNA合成試劑盒，以總RNA為模板，Oligo-dT為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA[14-18]，-20 ℃保存， 備用。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上已報道的鯊烯合成酶(SS)、人參細(xì)胞色素P450的CYP82D47、CYP716A42基因序列為參考，采用DANMAN、ClustalW、Blast等軟件找出高度保守區(qū)設(shè)計特異性克隆引物和熒光定量PCR特異性引物(表2)。

1.2.4 人參皂苷合成酶基因表達(dá)量測定 以5 a生石柱參11個生長時期(表1，A～K時期)根、莖、葉組織的cDNA為模板，分別對石柱參SS、細(xì)胞色素酶P450的CYP82D47、CYP716A42基因進(jìn)行qPCR擴增，每個反應(yīng)體系重復(fù)3次。qPCR在ABI Biosystems的熒光定量PCR儀7500上完成的，RT-PCR體系用2xSG Fast QPCR Master Mix試劑盒，采用PrimerExpress軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物，同時以人參親環(huán)蛋白基因CCYP為qPCR內(nèi)參基因(表2)。不同生長期的表達(dá)量以4月26日石柱參根組織表達(dá)量為對照[19-20]。qPCR擴增體系為20 μL：SYBR Premix ExTaq10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6.5 μL；熒光定量qPCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min； 94 ℃變性5 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。

表2 引物信息Table 2 The information of primers

1.2.5 重復(fù)性試驗 從“1.2.4”中5 a生石柱參不同生長時期根、莖、葉組織的相同部位分別取3份樣品，分別在同等條件下進(jìn)行擴增，每份樣品平均做3個平行試驗，作為生物學(xué)重復(fù)，分析其組內(nèi)及組間差異，以檢測該熒光定量PCR方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

1.2.6 石柱參CYP82D47基因擴增 分別以石柱參綠果期根、莖、葉為材料，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，克隆CYP82D47基因。反應(yīng)體系[12]為20 μL：ddH2O 7.8 μL，Mix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.6 BμL，Reverse Primer 0.6 μL，DNA模板 1 μL； PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.7 PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化與測序 采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，采用Takara公司Pmd20-T試劑盒，將得到的較高純度DNA連接到pMD20-T載體上，后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10 DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴增[22]，最終將陽性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將核苷酸序列在Blast在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，以此檢測克隆結(jié)果是否正確；并在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫和氨基酸數(shù)據(jù)庫中搜索近緣種的細(xì)胞色素P450基因序列信息，采用DNAMAN軟件分析序列的開放閱讀框、起始密碼子和終止密碼子，并翻譯出氨基酸序列，最后通過MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MxPro與SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和線性回歸分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 石柱參根、莖、葉組織總RNA提取質(zhì)量檢測

石柱參3個組織的總RNA電泳圖譜如圖1，28S rRNA和18S rRNA的條帶完整且清晰，二者亮度與寬度比值均接近2∶1，表明提取的總RNA完整性較好；經(jīng)檢測OD260/OD280為1.9～2.1，表明總RNA質(zhì)量較高，無污染，可用于后續(xù)試驗。

M.2 kb plus DNA ladder;1～3.石柱參根、莖、葉 Root,stem and leaves of Shizhu ginseng；4～6.人參根、莖、葉 Root,stem and leaves of ginseng

圖1 石柱參總RNA的提取
Fig.1 Total RNA extraction from shizhu ginseng

2.2 人參與石柱參中人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及線性關(guān)系

采用高效液相色譜法測定人參、石柱參綠果期不同部位人參皂苷，試驗重復(fù)測定4次，取平均值(表3)。可見，人參不同部位根、莖、葉人參皂苷總和的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.174 4%、7.623 7%、8.933 5%，均明顯高于石柱參根莖葉中人參皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.584 4%、1.895 2%、3.307 0%，可能是由于人參皂苷合成途徑中某種人參皂苷合成酶基因的表達(dá)量過低造成的；此外，人參、石柱參莖、葉中人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高，尤其是人參中Re達(dá)到4.013 8%(P<0.05)。分別取配好的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)操作液，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，獲得6種人參皂苷線性回歸方程，由表4可見，人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re 、Rg1、Rg2在標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0.016～ 3.500 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.3 石柱參人參皂苷合成酶基因的表達(dá)量

采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以人參Cyclophilin作為內(nèi)參基因，檢測5 a生石柱參11個生長時期(A～K)根、莖、葉組織中人參皂苷合成酶基因(SS、CYP82D47、CYP716A42)的表達(dá)量。

SS基因在5 a生石柱參根、莖、葉中不同生長時期的表達(dá)量見圖2?？梢?，石柱參根組織SS基因表達(dá)量從展葉期到紅果期無明顯變化，隨后至果熟期降為最低值，而在根生長期表達(dá)量有回升，但不高；莖組織SS基因表達(dá)量從展葉期到果熟期逐漸降低，尤其在根生長期幾乎不表達(dá)，而在枯萎期有少量回升；SS基因在葉組織展葉期表達(dá)量較高，從始花期至綠果初期表達(dá)量穩(wěn)步上升，達(dá)到峰值，約為根部表達(dá)量的3倍，在綠果末期至枯萎期其表達(dá)量逐步下降，而此時莖、葉組織的SS基因幾乎不表達(dá)，僅在根部有少量表達(dá)，說明SS基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在石柱參根、葉中表達(dá)活躍，在莖中表達(dá)量有限?？梢?，石柱參SS基因隨著生長周期的結(jié)束，其活躍程度降低，趨向于不表達(dá)狀態(tài)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后，各組間差異極顯著(P<0.01)。

表3 人參、石柱參不同藥用部位中人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Mass fraction of ginsenosides in ginseng and shizhu ginseng %

表4 6種人參皂苷的線性回歸方程Table 4 Linear regression equation of six ginsenosides

CYP82D47基因在5 a生石柱參根、莖、葉組織中不同生長時期的表達(dá)量(圖3)?？梢?，CYP82D47基因在根組織中的表達(dá)量除展葉期較高外，其余各生長期的表達(dá)均處于較低水平；在莖組織中，從展葉期至根生長期Ⅰ的CYP82D47基因表達(dá)量逐漸升高，并達(dá)到峰值，隨后下降，但仍高于同時期根組織的表達(dá)量；在葉組織中，從展葉期至綠果初期，其表達(dá)量穩(wěn)步上升，之后均具有較高的表達(dá)量，高于同時期根、莖的表達(dá)量，可見，CYP82D47基因在石柱參中的表達(dá)部位主要是莖、葉組織，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后，各組間差異極顯著(P<0.01)。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)，“*”表示差異顯著(P<0.05)；下圖同 “**”the difference was statistically very significant(P<0.01) ,“*”the difference was statistically significant (P<0.05)；the same below

圖2 石柱參人參皂苷合成酶SS基因qPCR表達(dá)分析
Fig.2 The qPCR relative expression analysis ofSSgene in shizhu ginseng

圖3 石柱參人參皂苷合成酶 CYP82D47基因qPCR表達(dá)分析Fig.3 The qPCR relative expression analysis of CYP82D47 gene in shizhu ginseng

CYP716A42基因在5 a生石柱參根、莖、葉組織中不同生長時期的表達(dá)量(圖4)?？梢?，CYP716A42基因在根部的表達(dá)與CYP82D47基因完全不同，其表達(dá)量先增高后降低，且在綠果末期達(dá)到峰值，約為展葉期的3倍(P<0.05)，隨后逐漸下降至枯萎期幾乎不表達(dá)；在莖組織中的表達(dá)不活躍，在結(jié)果期和綠果末期其表達(dá)量較高，隨后各生長期幾乎不表達(dá)；在葉組織中表達(dá)量變化較大，展葉期較高，至盛花期降低至不表達(dá)，隨后至綠果初期表達(dá)量逐步增加并出現(xiàn)峰值，隨后降低，但同期相比，葉組織中的CYP82D47基因在枯萎期表達(dá)水平遠(yuǎn)高于根、莖組織，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后，各組間差異極顯著(P<0.01)。

2.4 人參、石柱參人參皂苷合成酶基因表達(dá)量的比較

綜上所述，人參皂苷合成酶基因在石柱參綠果期的葉組織中相對表達(dá)量較高；所以，本試驗檢測同時期人參葉片中人參皂苷合成酶基因的表達(dá)量為對照組，結(jié)果如圖5，人參、石柱參的人參皂苷合成酶基因SS、CYP716A42在葉片組織綠果期的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，基因CYP82D47在葉片組織綠果期的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。

2.5 重復(fù)性試驗

熒光定量PCR對3個平行試驗檢測的結(jié)果計算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)表明，同一份樣品的組內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.12%～1.03%，同一植株相同部位3份樣品間的組間重復(fù)變異系數(shù)為 0.19%～ 1.92%(表5)，表明該方法具有較好的組內(nèi)和組間重復(fù)性。因此，說明本試驗建立的實時熒光定量PCR方法不僅靈敏度和準(zhǔn)確性高，而且穩(wěn)定性較好。

圖4 石柱參人參皂苷合成酶 CYP716A42基因qPCR表達(dá)分析Fig.4 The qPCR relative expression analysis of CYP716A42 gene in shizhu ginseng

2.6 石柱參 CYP82D47基因克隆鑒定

由于綠果期CYP82D47基因的表達(dá)量較高，所以分別以石柱參綠果期根、莖、葉為材料，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，采用細(xì)胞色素CYP82D47基因特異性引物擴增該基因，片段如圖所示(圖6)。

圖5 人參、石柱參人參皂苷合成酶基因表達(dá)量的比較Fig.5 Comparison of ginsenoside synthase gene expression in ginseng and shizhu ginseng

M.Marker；1～3.依次為以石柱參根、莖、葉組織cDNA為模板克隆的CYP82D47基因片段 Amplified fragment ofCYP82D47gene from Shizhu ginseng’s root,stem and leaves cDNA as the template

圖6CYP82D47基因克隆圖譜
Fig.6 Cloning map ofCYP82D47gene

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 Results of repeated experiments of real-time quantitative PCR assay

將純化得到的目的片段連接到pMD20-T載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10 DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中，采用菌落PCR方法檢測陽性克隆菌液，電泳得到約1 524 bp目的基因條帶，隨后對陽性克隆的菌液進(jìn)行測序，采用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行拼接，獲得細(xì)胞色素P450CYP82D47基因cDNA全長序列，片段大小為1 524 bp，起始密碼子位于114 bp，終止密碼子位于1 205 bp，開放閱讀框總長1 091 bp，共編碼氨基酸324個，序列如圖7。

根據(jù)石柱參細(xì)胞色素P450CYP82D47基因的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與其氨基酸序列相似度較高的序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)?？梢?，14個遺傳關(guān)系較近的品種聚為4個類群，第一類群2個品種，即楤木和刺楸；第二類群5個品種，即通草、羽葉三七、姜狀三七、三七和扣子七；第三類群4個品種，即西洋參、竹節(jié)參、人參和石柱參；第四類群3個品種，即無梗五加、細(xì)柱五加和刺五加。其中石柱參CYP82D47基因的氨基酸序列與人參、竹節(jié)參和西洋參親緣關(guān)系較近，說明該結(jié)果與物種進(jìn)化程度相符合。

圖7 CYP82D47基因cDNA序列Fig.7 cDNA sequence of CYP82D47 gene

圖8 石柱參 CYP82D47基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of CYP82D47 gene in shizhu ginseng

3 討 論

人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)是評價石柱參品質(zhì)的關(guān)鍵，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)受環(huán)境和人參皂苷合成酶的協(xié)同影響，人參皂苷合成酶基因的表達(dá)影響人參皂苷合成途徑中各物質(zhì)流向。曲正義等[22]對不同生長時期人參根、莖、葉中的人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定分析，發(fā)現(xiàn)人參中總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為葉>根>莖，人參葉片中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的單體皂苷是Re、Rd、Rb1和Rg1，人參根中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的單體皂苷是Rg1、Re和Rb1，人參莖中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的單體皂苷是Rg1和Re，牛云云等[23]發(fā)現(xiàn)三七人參皂苷合成酶基因在莖、葉中的表達(dá)量明顯高于根中，均與本文研究結(jié)果一致；此外，人參皂苷合成酶基因的表達(dá)在根、莖、葉組織中具有較高的組織差異性，比如SS基因在石柱參根、葉中表達(dá)活躍，而莖中表達(dá)量則有限，且石柱參SS基因隨著生長周期的結(jié)束，其活躍程度降低，趨向于不表達(dá)狀態(tài)；CYP82D47基因主要表達(dá)部位是莖、葉組織；而CYP716A42基因在根、莖、葉中表達(dá)較活躍，尤其是根、葉中；人參皂苷合成酶基因的表達(dá)量在綠果期葉片中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但由于基因表達(dá)量不穩(wěn)定且?guī)в胁▌有裕砸匀藚閷φ战M，檢測二者綠果期葉片中各人參皂苷合成酶基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同條件下，石柱參人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較人參差了近3倍，Han等[24]研究發(fā)現(xiàn)，人參CYP82D47在茉莉酸甲酯調(diào)控下表達(dá)量上調(diào)，而CYP82D47是一個尚未明確功能的P450羥化酶，所以造成人參皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的原因之一可能是人參皂苷合成酶基因CYP82D47的表達(dá)量相對較低，影響了人參皂苷合成過程中量的積累，該基因主要催化達(dá)瑪烷型原二醇到原人參二醇的C-12位羥基化，推進(jìn)了人參皂苷的生物合成。此外，克隆CYP82D47基因cDNA全長序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，由CYP82D47基因氨基酸序列及檢索相似度較高的序列建立石柱參系統(tǒng)進(jìn)化樹，可見，石柱參與人參、竹節(jié)參、西洋參等的親緣關(guān)系較近，結(jié)果與物種進(jìn)化程度相符合。CYP716A42和CYP82D47同為細(xì)胞色素P450超基因家族成員，深入研究CYP450s，并進(jìn)一步驗證其功能和作用位點，闡述人參皂苷合成酶基因的表達(dá)如何調(diào)控人參皂苷生物合成的生理生態(tài)機制，對今后在微生物中重建人參皂苷合成途徑、通過基因工程手段培育高質(zhì)量分?jǐn)?shù)人參皂苷的石柱參具有重要的實踐意義。