水飛薊素通過調(diào)控TLR/NF-κB信號通路改善急性肺損傷大鼠肺功能作用研究*

張強澤 曹 斌 梁志勇

（山東省濟南市人民醫(yī)院，山東 濟南 271100）

急性肺損傷（ALI）是指由于肺部感染、重癥胰腺炎或膿毒癥等因素導(dǎo)致肺組織細胞損傷，肺功能發(fā)生障礙的一種臨床綜合征，臨床表現(xiàn)為嚴重性低氧血癥和急性呼吸窘迫［1]。其中急性呼吸窘迫綜合征是ALI的嚴重階段，威脅患者生命安全。研究發(fā)現(xiàn)，感染等因素可導(dǎo)致炎性細胞在肺組織大量聚集，產(chǎn)生并分泌多種炎癥因子，損傷肺組織細胞，參與急性肺損傷中的發(fā)生過程［2]。另外，由于氣體交換受限，肺組織處于缺氧狀態(tài)，細胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)失控，也參與急性肺損傷病理過程［3]。水飛薊素（Silymarin）提取自菊科植物水飛薊的種子或果實，屬于黃酮木脂素類化合物，因其具有抗氧化、清除毒素、促進蛋白質(zhì)合成等功能，臨床已被應(yīng)用于治療肝臟損傷，效果優(yōu)良［4-5]，但是水飛薊素對ALI的保護作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建ALI大鼠模型，觀察水飛薊素對ALI大鼠肺功能的保護作用并初步研究其機制，旨在探討將水飛薊素用于治療ALI的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠105只，清潔級，許可證號：SCXK（滬）-2016-00015，體質(zhì)量 200～230 g，購于上海西普爾公司。所有大鼠集中進行常規(guī)飼養(yǎng)，本研究實驗動物使用均遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：水飛薊素片（規(guī)格：70 mg×20片，批號H20140470），購于德國MADAUS大藥廠；地塞米松片（規(guī)格 0.75 mg×100片，批號 H14023304），購于山西同達藥業(yè)公司；TLR4抑制劑TAK-242（純度99.95%，貨號HY-11109），購于美國 MCE公司；氯化鈉注射液（規(guī)格為 0.9 g∶100 mL，批號 H32023396），購于輔仁藥業(yè)公司；兔源Toll樣受體4（TLR4）抗體、兔源核轉(zhuǎn)錄因子 （NF）-κB p65抗體、兔源GALIDH抗體、兔源Lamin B抗體，羊抗兔IgG二抗，購于美國ABCam公司；蛋白提取試劑盒（細胞質(zhì)和細胞核）（貨號C006225-0050）、DAB顯色試劑盒（貨號 A600885-0200），購于上海生工公司；單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA 試劑盒、 白細胞介素 （IL）-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）試劑盒，購于碧云天公司。 2）儀器：石蠟切片機（RM2025），購于德國Leica公司；自動血氣分析儀（ABL 800 FLEX），購于美國 Radiometer公司。

1.3 分組與造模 將105只Wistar大鼠按照隨機數(shù)字表法分為7組，每組15只，分別為：對照組、ALI組、地塞米松組和低、中、高劑量水飛薊素組、TAK-242組。除對照組外，其余大鼠均采用尾靜脈注射脂多糖（5 mg/kg）法建立 ALI模型［6]，出現(xiàn)輕微肺啰音者則為造模成功，對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水。實驗期間若大鼠出現(xiàn)意外死亡，則從備用大鼠中按上述方法建立ALI模型補足。

1.4 給藥方法 造模成功后，立即給予各組大鼠相應(yīng)藥物。地塞米松、水飛薊素給藥溶液的制備：稱取適量地塞米松片和水飛薊素片，粉碎后分別加入0.9%氯化鈉注射液中，制備成0.09 mg/mL地塞米松溶液和1.5、3.0、6.0 mg/mL水飛薊素溶液，即配即用。大鼠用藥濃度按照按體表面積法根據(jù)人類劑量分別計算得到。低、中、高劑量水飛薊素組分別給予15、30、60 mg/kg水飛薊素灌胃給藥。地塞米松組給予0.9 mg/kg地塞米松灌胃給藥。TAK-242組給予0.5 mg/kg TAK-242尾靜脈注射給藥。對照組和ALI組灌胃給予等量生理鹽水，灌胃容積為10 mL/kg。給藥3 d，每日1次。

1.5 標本采集與檢測 給藥24 h后，麻醉各組大鼠，暴露腹主動脈，采用血氣針取血2 mL，然后處死各組大鼠，暴露胸腔，結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)主氣管將2 mL磷酸緩沖液注射入左側(cè)肺泡，灌洗3次，收集肺泡灌洗液約5.6 mL，離心后保留上清待測，-20℃保存。取大鼠右側(cè)肺臟下部組織，置于4%多聚甲醛中固定待用；另取右側(cè)肺臟上中部組織，除去表面多雜質(zhì)，稱量并記錄其濕重（W），置于60℃恒溫箱中干燥。1）動脈血氣分析：采用全自動血氣分析儀檢測各組大鼠動脈血中二氧化碳分壓（PaCO2）和氧分壓（PaO2）水平。 2）肺濕/干比（W/D）測定：右側(cè)肺部上中部肺組織于恒溫箱中干燥72 h后，稱量并記錄，計算肺W/D比重。3）肺組織病理形態(tài)變化檢測：大鼠肺組織石蠟切片脫蠟、水化后，按照蘇木精-伊紅（HE）進行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠肺組織形態(tài)。4）肺泡灌洗液中SOD、MPO活性和炎癥因子水平檢測：分別采用SOD檢測試劑盒、MPO檢測試劑盒、MCP-1 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒檢測肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β和TNF-α含量。5）肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達檢測：研磨肺冷凍組織，采用試劑盒分別提取細胞質(zhì)和細胞核總蛋白，BCA試劑盒測定肺組織中蛋白質(zhì)總量。經(jīng)SDS-凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)從SDS-凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜；采用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h；分別加入一抗兔源TLR4抗體、兔源NF-κB p65抗體、兔源GALIDH抗體、兔源Lamin B 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；之后加入二抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h。經(jīng)DAB顯色試劑處理后采用Tanon軟件拍攝蛋白條帶圖像并分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，行單因素方差分析，兩兩比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平的比較 見表1。與對照組比較，ALI組大鼠W/D、PaCO2水平明顯增高（P＜0.05），PaO2水平明顯下降（P＜0.05）；與 ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組大鼠W/D、PaCO2水平均明顯降低 （P＜0.05），PaO2水平明顯增高（P＜0.05）。

表 1 各組大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

表 1 各組大鼠 W/D、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與 ALI組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n PaO2（mmHg）對照組 15 96.48±11.54 ALI組 15 49.34±8.21*地塞米松組 15 87.65±9.64*△7.13±1.21*△ 51.63±3.38*△中劑量水飛薊素組 15 6.07±1.09*△ 47.16±3.25*△ 77.56±6.75*△高劑量水飛薊素組 15 4.79±0.78*△ 40.58±2.74*△ 89.17±8.35*△TAK-242 組 15 4.91±0.83*△ 39.37±1.46△ 86.75±5.94*△W/D PaCO2（mmHg）4.35±0.85 38.17±3.76 8.42±1.65* 59.64±4.61*5.06±0.97*△ 39.18±3.26*△低劑量水飛薊素組 15 61.33±5.78*△

2.2 各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)變化比較 見圖1。對照組大鼠肺泡明顯，肺間質(zhì)無水腫、未見炎性細胞和紅細胞，肺組織結(jié)構(gòu)正常；ALI組肺泡壁不規(guī)則，出現(xiàn)碎片填充、肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細胞和紅細胞滲透，肺組織呈現(xiàn)病理損傷；低、中、高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組肺組織病變均不同程度減輕，其中高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組大鼠的肺組織基本趨于正常。

圖1 各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠SOD、MPO活性的比較 見表2。與對照組比較，ALI組大鼠肺泡灌洗液中SOD和MPO活性明顯降低（P＜0.05）；與 ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組大鼠肺泡灌洗液中SOD和MPO活性明顯增強（P＜0.05）。

表2 各組大鼠 SOD、MPO活性比較（U/mL，±s）

表2 各組大鼠 SOD、MPO活性比較（U/mL，±s）

組 別 n對照組 15 ALI組 15地塞米松組 15 SOD MPO 163.21±20.45 209.46±27.56 85.14±14.95* 97.25±16.42*162.68±21.13*△ 187.62±23.54*△低劑量水飛薊素組 15 97.63±18.54*△ 109.34±19.21*△中劑量水飛薊素組 15 123.34±18.37*△ 129.75±16.94*△高劑量水飛薊素組 15 142.29±23.56*△ 168.34±25.64*△TAK-242 組 15 149.36±18.76*△ 163.72±21.73*△

2.4 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的比較見表3。與對照組比較，ALI組大鼠肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β 和 TNF-α 水平明顯增高（P＜0.05）；與 ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組大鼠肺泡灌洗液中MCP-1、IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組 別 n TNF-α對照組 15 231.23±22.49 ALI組 15 679.19±49.86*地塞米松組 15 283.74±19.98*△53.61±8.52*△ 391.57±31.62*△中劑量水飛薊素組 15 36.78±6.26*△ 263.15±24.63*△ 418.43±42.38*△高劑量水飛薊素組 15 25.73±4.31*△ 192.46±21.98*△ 273.29±29.78*△TAK-242 組 15 26.35±4.27*△ 175.67±17.52*△ 219.72±21.53*△MCP-1 IL-1β 14.53±3.32 134.26±19.43 68.47±12.11*449.57±49.31*24.83±4.13*△ 187.25±34.97*△低劑量水飛薊素組 15 584.72±32.54*△

2.5 各組大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達的比較 見圖2，表4。與對照組比較，ALI組大鼠肺組織TLR4蛋白表達上調(diào) （P＜0.05）、NF-κB蛋白核移位程度增加（P＜0.05）；與 ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組、地塞米松組和TAK-242組大鼠肺組織TLR4蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）、NF-κB蛋白核移位程度降低。

圖2 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB通路蛋白表達

3 討 論

ALI是導(dǎo)致患者發(fā)生急性呼吸衰竭危急癥的主要因素，嚴重者導(dǎo)致患者死亡。危重癥患者易受到病原菌感染，由此引發(fā)的膿毒癥等可進一步誘發(fā)ALI，脂多糖作為病原菌細胞壁的主要成分之一，可誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生。本研究采用尾靜脈注射脂多糖法構(gòu)建ALI大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂多糖可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)低氧血癥和肺水腫，造成肺組織病變，表明模型制備成功。肺臟是人體負責(zé)氣血交換的重要器官，其功能障礙可累及其他臟器，對機體健康非常重要。據(jù)報道，采用具有抗氧化或抗炎活性的藥物治療可顯著改善膿毒癥等造成急性肺損傷，應(yīng)用前景較好［6-7]。水飛薊素是來自水飛薊的醇提取物，具有清除氧自由基、促進細胞中蛋白質(zhì)合成、促進細胞修復(fù)等功能［8]。Farjad等研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可顯著改善鎘處理所致小鼠的氧化應(yīng)激損傷，增強小鼠對血清脂質(zhì)過氧化清除能力和抗氧化防御能力［9]。本研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可明顯降低W/D、PaCO2水平，提高PaO2水平，改善肺組織病變程度，提示水飛薊素對ALI大鼠肺功能具有保護作用，但相關(guān)作用機制不清楚。

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB通路蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB通路蛋白表達比較（±s）

組 別 n TLR4/GAPDH對照組 15 0.41±0.11 ALI組 15 1.09±0.15*地塞米松組 15 0.51±0.09*△1.04±0.17*△ 0.94±0.13*△水飛薊素中劑量組 15 0.62±0.11*△ 1.17±0.19*△ 1.06±0.09*△水飛薊素高劑量組 15 0.29±0.06*△ 1.91±0.28*△ 0.65±0.13*△TAK-242 組 15 0.59±0.12*△ 1.28±0.16*△ 0.69±0.15*△核NF-κB/LaminB 質(zhì) NF-κB/GAPDH 0.71±0.15 1.95±0.37 2.28±0.43* 0.82±0.13*0.56±0.09*△ 1.21±0.25*△水飛薊素低劑量組 15 1.13±0.14*△

氧自由基等活性氧含量增多所導(dǎo)致的肺組織細胞氧化損傷，在ALI損傷過程中發(fā)揮著重要作用［10]?；钚匝跏且活惥哂休^強氧化活性、非常活潑的化學(xué)物質(zhì)，一般情況下，機體中存在SOD和MPO等具有清除活性氧功能的酶，防止活性氧在機體內(nèi)過量堆積，造成損傷［11]。當ALI發(fā)生時，由于肺組織處于損傷狀態(tài)時，SOD和MPO等抗氧化酶活性受到抑制，清除氧自由基的能力降低，導(dǎo)致機體內(nèi)累積過量氧自由基，進一步引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)氧化，造成組織細胞損傷［12]。Ronchi等研究顯示，吸入一氧化氮可明顯提高ALI模型兔氧合能力，增強抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激所致DNA損傷，改善肺損傷，保護肺功能［13]。另外，炎癥反應(yīng)在膿毒癥等所致ALI疾病發(fā)展中也具有重要作用。Gerin研究表明，槲皮素可通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子水平，保護膿毒癥所致大鼠肺損傷［14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，ALI組大鼠肺組織SOD和MPO活性明顯降低，MCP-1、IL-1β和 TNF-α水平明顯增高；與ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組和TAK-242組肺組織SOD和MPO活性明顯增高，MCP-1、IL-1β和TNF-α水平明顯降低。表明水飛薊素處理可增加ALI大鼠肺組織中SOD等抗氧化酶活性，降低肺組織中MCP-1等炎癥因子水平，且與TLR4特異性抑制劑TAK-242作用一致，提示水飛薊素抑制機體氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的作用可能與TLR4通路有關(guān)。

研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生與TLR4/NF-κB通路過度激活有關(guān)［15]。在哺乳動物細胞中，Toll樣受體同時作為先天性免疫受體和模式識別受體，參與先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)，分布于白細胞、樹突狀細胞等表面，參與識別多種病原物，啟動免疫反應(yīng)［16]。一些Toll樣受體如TLR4，與炎癥信號通路的激活密切相關(guān)，參與多種疾病發(fā)生和發(fā)展［17]。當受到外界病原物刺激，細胞中TLR4表達增加，激活下游炎癥因子如TNF-α轉(zhuǎn)錄，之后TNF-α可促進細胞質(zhì)中NF-κB進入細胞核而活化，活化后的NF-κB可進一步激活 IL-1β、MCP-1 等炎癥相關(guān)因子表達［18]。Chi等發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可能通過抑制TLR4/NF-κB激活，抑制炎癥反應(yīng)，改善原位自體肝移植所致大鼠急性肺損傷［19]。Jiang Q等研究顯示，白藜蘆醇苷可通過下調(diào)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達，降低IL-6等炎癥因子水平，改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷［20]。本研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖引起大鼠急性肺損傷過程中，肺組織TLR4蛋白表達上調(diào)、NF-κB核移位增加；與ALI組比較，低、中、高劑量水飛薊素組和TAK-242組大鼠肺組織TLR4蛋白表達下調(diào)、NF-κB核移位降低，表明水飛薊素可抑制TLR4表達和NF-κB核移位，與TAK-242作用一致，提示水飛薊素可能通過抑制TLR4/NF-κB通路激活發(fā)揮對ALI大鼠肺功能的保護作用。

綜上所述，水飛薊素可能通過抑制TLR4/NF-κB通路激活，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進而改善急性肺損傷大鼠肺功能。