HIV抗體無(wú)創(chuàng)(口腔黏膜滲出液及尿液)檢測(cè)試劑與有創(chuàng)(血液)檢測(cè)試劑的性能比較

葉 黎，陳曉茹，蘇 玲，梁 姝，楊 洪，袁 丹，楊 文△

(1.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.涼山州疾病預(yù)防控制中心，四川西昌 615000)

截至2017年11月30日全國(guó)報(bào)告現(xiàn)存活人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者754 852例[1]。而地處川滇黔交界處的四川省涼山彝族自治州(簡(jiǎn)稱涼山州)是我國(guó)AIDS的高流行區(qū)之一[2]。截至2015年12月涼山州累計(jì)報(bào)告的HIV/AIDS共計(jì)38 568例,居四川省第1位[3]。涼山州彝族地區(qū)艾滋病防治形勢(shì)日益嚴(yán)峻，擴(kuò)大HIV抗體的篩查是早發(fā)現(xiàn)、早治療的基礎(chǔ)，對(duì)控制艾滋病的傳播和流行具有至關(guān)重要的作用。目前，檢測(cè)HIV抗體最常用的方法是對(duì)血液樣本進(jìn)行初篩檢測(cè)，再進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)加以確認(rèn)。但常規(guī)方法均需采集血液，為有創(chuàng)采樣。部分高危人群或地處偏遠(yuǎn)山區(qū)的人群對(duì)有創(chuàng)采血接受度較低。在一定程度上影響了這類人群的檢測(cè)意愿,不利于擴(kuò)大檢測(cè)范圍。因此，理想的HIV檢測(cè)方法應(yīng)具有無(wú)損傷性、安全性、靈敏性等特點(diǎn)。有研究表明，HIV感染者尿液、唾液、精液、淚液均含有HIV抗體[4-6]；口腔黏膜滲出液、尿液較易采集且采集過(guò)程無(wú)創(chuàng)，因此，HIV無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑的上市為擴(kuò)大檢測(cè)范圍提供了新的選擇[7-8]?！度珖?guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2015年修訂版)也將口腔黏膜滲出液及尿液作為了新的HIV檢測(cè)樣品種類。2017年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的全國(guó)HIV抗體診斷試劑臨床質(zhì)量評(píng)估報(bào)告顯示，2015-2017年麗珠HIV抗體酶聯(lián)免疫試劑的靈敏度均為100.00%、特異度為98.61%～100.00%[9]。因此，本研究將以麗珠HIV抗體酶聯(lián)免疫試劑作為對(duì)比試劑，評(píng)估目前市面上常用的1種檢測(cè)原理為免疫層析法的口腔黏膜滲出液試劑A、1種檢測(cè)原理為免疫滲濾法口腔黏膜滲出液試劑B和1種檢測(cè)原理為酶聯(lián)免疫法尿液HIV抗體檢測(cè)試劑C的檢測(cè)性能，旨在為無(wú)創(chuàng)檢測(cè)在HIV1/2抗體篩查中的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2017年10月至2018年3月招募涼山州布拖縣年齡6～65歲的HIV感染者100例，未知感染狀態(tài)的體檢者200例。不包括經(jīng)期婦女。

1.2儀器與試劑

1.2.1評(píng)價(jià)試劑A HIV 1/2口腔黏膜滲出液檢測(cè)試劑(免疫層析法)，廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑批號(hào)：W06370730，有效期：2019-7-10。

1.2.2評(píng)價(jià)試劑B 口腔黏膜滲出液HIV1+2型抗體檢測(cè)試劑(免疫滲濾法)，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，試劑批號(hào)：ID20170602，有效期：2018-05。

1.2.3評(píng)價(jià)試劑C HIVⅠ型尿液抗體檢測(cè)試劑(酶聯(lián)免疫法)，北京君禾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，有效期：2018-5-14。

1.2.4對(duì)比試劑 HIV抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，珠海麗珠試劑股份有限公司生產(chǎn)，試劑批號(hào)：2018030812，有效期：20190313。

1.2.5確證試劑 HIV 1+2型抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法)，上海英旻泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑批號(hào)：IMT 1612001，有效期：2018-12-07。

1.2.6儀器 酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、37 ℃孵箱、全自動(dòng)免疫印跡儀、普通冰箱等。

1.3方法

1.3.1口腔黏膜滲出液樣本的采集 醫(yī)務(wù)人員在100例HIV感染者中隨機(jī)選擇55例采集，45例為醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)受檢者采集。

1.3.1.1口腔黏膜滲出液樣本A 從評(píng)價(jià)試劑A包裝中取出口腔取樣器，用取樣器的采樣端沿受試者上、下齒齦輕輕來(lái)回擦拭，用時(shí)5～6 s。再翻轉(zhuǎn)取樣器，沿受試者上、下齒齦輕輕來(lái)回擦拭，用時(shí)5～6 s。將口腔取樣器插入裝有樣本處理液的樣本提取管內(nèi)，緊貼提取管壁，上、下刮擦6～8次。從提取管中取出口腔取樣器，完成取樣。采集完成的樣本于2～8 ℃保存待檢。

1.3.1.2口腔黏膜滲出液樣本B 從評(píng)價(jià)試劑B鋁箔袋中取出無(wú)菌采集器，將采集器海綿端置于受檢者舌下5 min，待海綿軟化后將海綿在牙齦外周來(lái)回擦拭1～2 min。將采集器海綿端置擠壓裝置內(nèi)，用力垂直擠壓采集器手柄，并將擠出的液體收集于樣品管中，完成取樣。采集完成的樣本于2～8 ℃保存待檢。

1.3.2尿液標(biāo)本C的采集 采集受檢者清潔中段尿2～5 mL于一次性清潔尿杯內(nèi)，檢測(cè)人員使用無(wú)菌吸管吸取1.5 mL尿液至凍存管中，于2～8 ℃保存待檢。

1.3.3血液標(biāo)本的采集 采集受檢者乙二胺四乙酸抗凝全血6～10 mL，輕輕顛倒混勻6～8次。于6 h內(nèi)1 500 r/min離心15 min取上層血漿，于2～8 ℃保存待檢。

1.3.4樣本檢測(cè) 口腔黏膜滲出液標(biāo)本于采樣完成后12 h內(nèi)完成檢測(cè)，血液、尿液標(biāo)本于采樣完成后1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，所有樣本的檢測(cè)均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。尿液HIV-1抗體臨界值為0.25，光密度(OD)值大于或等于0.25為陽(yáng)性(+)，<0.25為陰性(-)。血液標(biāo)本使用麗珠酶聯(lián)免疫法進(jìn)行初篩，初篩陽(yáng)性按檢測(cè)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢陽(yáng)性者使用IMT HIV抗體確證檢測(cè)試劑確認(rèn)其感染狀況。將3種評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)結(jié)果與對(duì)比試劑進(jìn)行比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；2種方法一致性比較用Kappa檢驗(yàn)。根據(jù)邊緣概率的計(jì)算，κ=-1～1?！?.8 為二者具有高度一致性，0.8～0.4為二者具有中度一致性，<0.4為二者不一致。比較評(píng)價(jià)試劑與對(duì)比試劑的受試者工作特征(ROC)曲線下面積，檢測(cè)其檢驗(yàn)效能。對(duì)樣本成功采樣的定義為受檢者愿意接受標(biāo)本采集，且能收集到符合試劑盒說(shuō)明書要求的樣本量。采樣成功率=成功采樣數(shù)/采樣人數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1采樣成功率分析 按試劑盒說(shuō)明書的采樣要求，不同樣本采樣成功率見(jiàn)表1。所有受試者均接受尿液和口腔黏膜滲出液的采集。尿液樣本采集成功率為100.00%。口腔黏膜滲出液采集，按評(píng)價(jià)試劑A的采樣要求，采集成功率為99.00%，失敗的3例樣本原因?yàn)檎Z(yǔ)言溝通不暢，樣本缺失；但按評(píng)價(jià)試劑B的采樣要求，采集成功率僅為81.00%，失敗原因均為未收集到試劑盒說(shuō)明書要求的樣本量。有6.00%的受試者(18/300)拒絕采集其血液樣本。評(píng)價(jià)試劑A使用醫(yī)務(wù)人員采樣方式和醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)受檢者采樣方式的采樣成功率均為100%(45/45、55/55)。評(píng)價(jià)試劑B使用醫(yī)務(wù)人員采樣方式的采樣成功率[96.36%(53/55)]高于醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)受檢者采樣方式的采樣成功率[86.67%(39/45)]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.162,P>0.05)。

2.2評(píng)價(jià)試劑A、B與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果比較 評(píng)價(jià)試劑A與對(duì)比試劑均有結(jié)果者280份，其中110份血液樣本對(duì)比試劑初篩陽(yáng)性，后經(jīng)IMT確認(rèn)試劑確認(rèn)均為陽(yáng)性。評(píng)價(jià)試劑A的陽(yáng)性符合率為98.21%[95%可信區(qū)間(95%CI)：93.06～99.69]，陰性符合率為98.81%(95%CI：95.32～99.79),總符合率為98.57%(95%CI：96.13～99.54)。評(píng)價(jià)試劑A與對(duì)比試劑一致性較好(κ=0.970)。評(píng)價(jià)試劑B與對(duì)比試劑均有結(jié)果者233份，其中89份血液樣本對(duì)比試劑陽(yáng)性，經(jīng)IMT確認(rèn)試劑確認(rèn)均為陽(yáng)性。評(píng)價(jià)試劑B的陽(yáng)性符合率為90.82%(95%CI：82.84～95.45)，陰性符合率為96.24%(95%CI：91.00～98.61)，總符合率為93.94%(95%CI：89.82～96.52)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.68%(95%CI：87.45～98.03)，陰性預(yù)測(cè)值為93.43%(95%CI：87.53～96.76)。評(píng)價(jià)試劑B與對(duì)比試劑一致性較好(κ=0.875)。見(jiàn)表2。

表1 4種樣本采集情況比較(n=300)

表2 評(píng)價(jià)試劑A、B與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果比較

2.3評(píng)價(jià)試劑C與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果比較 評(píng)價(jià)試劑C與對(duì)比試劑均有結(jié)果者282份，其中112份血液樣本參考試劑陽(yáng)性，經(jīng)IMT確認(rèn)試劑確認(rèn)均為陽(yáng)性。評(píng)價(jià)試劑C的陽(yáng)性符合率為97.32%(95%CI：91.79～99.31)，陰性符合率為95.29%(95%CI：90.61～97.80)，總符合率為96.10%(95%CI：92.93～97.94)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.16%(95%CI：86.55～96.79)，陰性預(yù)測(cè)值為98.18%[(95%CI：94.36～99.53)]。評(píng)價(jià)試劑C與對(duì)比試劑一致性較好(κ=0.919)。見(jiàn)表3。8例假陽(yáng)性樣本中OD值為0.250～0.500 6例。3例假陰性標(biāo)本的OD值分別為0.090、0.060、0.135。見(jiàn)表4。

表3 評(píng)價(jià)試劑C與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果比較

表4 11份尿液和血液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果不符合標(biāo)本結(jié)果比較

2.4評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)HIV抗體的ROC曲線比較 評(píng)價(jià)試劑A、B、C檢測(cè)HIV抗體的ROC曲線下面積分別為0.991、0.935、0.975(95%CI：0.977～1.000、0.897～0.973、0.951～0.998)。見(jiàn)圖 1。提示3種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑檢測(cè)HIV抗體的準(zhǔn)確性均較高。

圖1 評(píng)價(jià)試劑A、B、C檢測(cè)HIV抗體的ROC曲線

3 討 論

本研究招募的自愿接受檢測(cè)服務(wù)的300例參試者均同意自行或由醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行口腔黏膜滲出液及尿液的采集；但有6.00%(18/300)的參試者拒絕采集其血液進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，部分彝族群眾對(duì)采血有恐懼心理，易造成暈針、暈血，甚至由此引發(fā)群體事件[10]。無(wú)創(chuàng)樣本采集方式可接受度更高。

本研究結(jié)果顯示，不同的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)樣本采集的成功率有差異，尿液(自行采集)采集成功率為100.00%，口腔黏膜滲出液評(píng)價(jià)試劑B的采樣成功率相對(duì)較低，為81.00%，分析原因可能為：(1)樣本要求較高，受檢者在口干的狀態(tài)下無(wú)法成功采集。(2)評(píng)價(jià)試劑B的采樣步驟相對(duì)于其他試劑稍顯復(fù)雜，受檢者需先將采集器的海綿端在舌下含軟(約需5 min以上時(shí)間)，再擦拭牙齦外周，用時(shí)稍長(zhǎng)，部分受檢者不能掌握正確的采樣方式。口腔黏膜滲出液評(píng)價(jià)試劑A采樣成功率較高，為99.00%，因其采集要求相對(duì)簡(jiǎn)單，需受檢者配合的部分較少。另外，使用醫(yī)務(wù)人員采樣方式和醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)受檢者自行采樣方式的口腔黏膜滲出液的采樣成功率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)后受檢者即可正確掌握無(wú)創(chuàng)檢測(cè)樣本的采樣方式，提示為擴(kuò)大HIV檢測(cè)覆蓋面，可推廣無(wú)創(chuàng)檢測(cè)或無(wú)創(chuàng)自檢的檢測(cè)模式。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，口腔黏膜滲出液中免疫球蛋白G抗體濃度約相當(dāng)于血清中的1/20[11]；對(duì)口腔黏膜滲出液檢測(cè)試劑的靈敏度提出了較高要求。本研究結(jié)果顯示，口腔黏膜滲出液評(píng)價(jià)試劑A陽(yáng)性符合率、陰性符合率均高于評(píng)價(jià)試劑B，是否由于2種試劑的采樣方式和檢測(cè)原理不同而導(dǎo)致的差異，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

口腔黏膜滲出液中可能含有的其他物質(zhì)如病毒、細(xì)菌、膽紅素等，以及吸煙、服藥、牙周炎等因素均可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性[12]；一些經(jīng)抗病毒治療,病毒載量減少者也有可能出現(xiàn)漏檢。本研究使用的尿液試劑C與對(duì)比試劑的符合率較高,進(jìn)一步對(duì)尿液檢測(cè)OD值分析發(fā)現(xiàn)，8例假陽(yáng)性樣本中中OD值為0.250～0.500 6例，提示OD值在0.50以下可能為尿液檢測(cè)的灰區(qū)[13]。對(duì)處于灰區(qū)范圍的樣本重復(fù)采樣檢測(cè)或采集血液進(jìn)行檢測(cè)可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

在HIV感染者的尿液檢測(cè)結(jié)果中，219號(hào)樣本的OD值為0.135，有可能該樣本為非受檢者本人的。因尿液標(biāo)本的采集具有一定的隱私性，在樣本采集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別受檢者使用水代替尿液標(biāo)本，所以，不排除個(gè)別受檢者使用他人的樣本代替本人樣本。

尿液HIV抗體的檢測(cè)受患者體內(nèi)抗體和病毒載量水平高低的影響，當(dāng)處于HIV感染的早期階段或艾滋病終末期則抗體水平較低或經(jīng)抗病毒治療患者血中病毒載量水平較低，相應(yīng)地尿中抗體含量較低，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。另外，尿液中成分復(fù)雜，細(xì)胞、蛋白質(zhì)、鹽類等，這些因素是否會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性尚需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

傳統(tǒng)的血液檢測(cè)方法由于需有創(chuàng)采集樣本，不但增加了醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也降低了高危人群和害怕采血人群的檢測(cè)意愿。本研究評(píng)價(jià)的3種HIV抗體無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑與有創(chuàng)試劑比較，具有較好的一致性，符合率較高。因此，無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑作為一種初篩檢測(cè)試劑，對(duì)醫(yī)療條件有限、采血困難的兒童、肥胖者、靜脈萎縮者等，以及具有特殊風(fēng)俗習(xí)慣的少數(shù)民族地區(qū)將能極大地提高人群篩查率，為AIDS的預(yù)防和控制提供了新的檢測(cè)途徑。