利用下一代測(cè)序進(jìn)行的羅氏易位攜帶者1例遺傳學(xué)診斷

鄧 慶，馬 健

(1.錦江生殖成都西囡婦科醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川成都 610000；2.四川錦欣婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 610000)

羅氏易位指2個(gè)近端著絲粒染色體在著絲處或其附近斷裂后融合成為1個(gè)染色體，導(dǎo)致染色體數(shù)減少，長(zhǎng)臂數(shù)不變，短臂數(shù)減少2條的現(xiàn)象。羅氏易位發(fā)生在5條近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22號(hào)染色體)上，羅氏易位攜帶者只有45條染色體，缺少1條染色體[1]。其人群攜帶率為1.23/1 000，占不孕人群的2%～3%[2]。

一般而言，發(fā)生羅氏易位的5條染色體短臂的丟失不會(huì)對(duì)個(gè)體發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。雖然表型正常，由于在第1次減數(shù)分裂過(guò)程中羅氏易位攜帶者生殖細(xì)胞易位染色體和相應(yīng)2個(gè)正常染色體配對(duì)會(huì)形成3價(jià)染色體，這種結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致交替、鄰式和不常見3∶0 3種分裂方式的出現(xiàn)[3]。只有交替可產(chǎn)生正常或平衡的配子，其他2種方式產(chǎn)生非平衡的配子，一旦羅氏易位攜帶者與健康者婚配，這種占大部分的非平衡配子可能會(huì)導(dǎo)致易位攜帶者出現(xiàn)妊娠困難或妊娠過(guò)程中反復(fù)流產(chǎn)，甚至?xí)?dǎo)致21-三體綜合征、13-三體綜合征等先天缺陷患兒的出生[4]。

羅氏易位是導(dǎo)致不孕及妊娠質(zhì)量不高的一種家族遺傳性疾病[5]。本研究選取一對(duì)有過(guò)胚胎停育和自然流產(chǎn)史、女方屬高齡產(chǎn)婦、男方攜帶羅氏易位衍生染色體的夫婦，通過(guò)對(duì)其體外受精得到的胚胎進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，通過(guò)一定的分析方法進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證從而挑選出正常合適的胚胎進(jìn)行移植，可避免臨床上羅氏易位攜帶者異常胚胎植入后的選擇性終止妊娠，大幅度降低了婦女身心痛苦和妊娠失敗風(fēng)險(xiǎn)，阻斷羅氏易位疾病的垂直傳播[6]；減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。

1 資料與方法

1.1樣本來(lái)源 女方37歲，1次胚胎停育，3次自然流產(chǎn)。男女雙方染色體核型分析：女方核型正常，男方羅氏易位攜帶45，XY，-13,-14，+Rob(13∶14)。申請(qǐng)胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)技術(shù)助孕，采用促排卵方案后采卵1次，體外受精得到囊胚4枚，通過(guò)胚胎活檢對(duì)4個(gè)囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行采樣同時(shí)采取夫妻雙方外周血基因組樣本，通過(guò)達(dá)瑞生殖PGS檢測(cè)篩查出染色體不平衡胚胎，并經(jīng)倫理學(xué)審查和達(dá)瑞生殖技術(shù)性手段胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)來(lái)檢測(cè)與構(gòu)建受檢胚胎的單體型。

1.2儀器及耗材 REPLI-g?single Cell Kit(24)購(gòu)自QIAGEN企業(yè)管理(上海)有限公司，Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0購(gòu)自美國(guó)life公司，Agencourt AMPure XP購(gòu)自美國(guó)BECKMAN公司，QubitTMdsDNA HS Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Life公司，KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit購(gòu)自美國(guó)KAPA公司，PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑購(gòu)自日本TaKaRa，所有引物合成自美國(guó)invitrogen公司，測(cè)序試劑均購(gòu)自美國(guó)life公司。Qubit?3.0 Fluorometer熒光計(jì)購(gòu)自美國(guó)Life公司，定性PCR儀(ABI3130)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)均購(gòu)自美國(guó)ABI公司，DA8600半導(dǎo)體測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)Life公司。

1.3方法

1.3.1單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增 基于準(zhǔn)隨機(jī)引物線性擴(kuò)增的原理并根據(jù)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(REPLI-g?single Cell Kit)說(shuō)明書對(duì)每個(gè)囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解、預(yù)擴(kuò)增、指數(shù)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物純化，產(chǎn)物濃度稀釋10倍后經(jīng)熒光定量?jī)x(Qubit 3.0)測(cè)濃度。

1.3.2文庫(kù)構(gòu)建 100 ng DNA經(jīng)文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Ion AmpliseqTMLibrary Kit 2.0)構(gòu)建文庫(kù)DNA。PCR特異性擴(kuò)增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測(cè)序接頭，PCR擴(kuò)增文庫(kù)DNA，磁珠純化去除雜質(zhì)；文庫(kù)構(gòu)建后Qubit 3.0測(cè)濃度。多重PCR所需引物250對(duì)均用Ampliseq網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成。

1.3.3高通量測(cè)序文庫(kù)qPCR定量 根據(jù)Qubit 3.0測(cè)定的濃度結(jié)果，取2 μL文庫(kù)樣品稀釋至200 pM。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(KAPA SYBR?FAST Universal qPCR Kit)配制反應(yīng)總體系。稀釋后的文庫(kù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各取4 μL進(jìn)行定量。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)循環(huán)數(shù)計(jì)算每個(gè)文庫(kù)樣本的實(shí)際濃度。

1.3.4上機(jī)模板制備與測(cè)序 根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量和測(cè)序深度確定文庫(kù)的混樣個(gè)數(shù)進(jìn)行模板制備，使用模板制備試劑盒(Ion PGMTM Template OT2 200 kit)制備測(cè)序模板；然后進(jìn)行陽(yáng)性模板的富集即去除雜質(zhì)及擴(kuò)增失敗的測(cè)序模板；最后使用高通量測(cè)序試劑盒(Ion PGMTM Sequencing 200 kit v2)在 PGMTM測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)行生物信息分析。首先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，去除接頭序列，通過(guò)Torrent Mapping Alignment Program軟件比對(duì)到人類基因組參考序列hg19上，通過(guò)samtools統(tǒng)計(jì)覆蓋倍數(shù)，通過(guò)GATK calling SNP基因型分析，最后結(jié)合家系進(jìn)行SNP連鎖分析，對(duì)患者樣本13、14號(hào)染色體進(jìn)行單體型構(gòu)建，進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié) 果

2.1胚胎測(cè)序結(jié)果分析 下一代測(cè)序(NGS)檢測(cè)結(jié)果匯總見表1。F為父親樣本，M為母親樣本，F(xiàn)1、F2為父親樣本13號(hào)染色體的2條染色體單體(其中F1為父親攜帶的13號(hào)與14號(hào)發(fā)生了羅氏易位的衍生染色體)，M1、M2為母親樣本13號(hào)染色體的2條染色體單體。1號(hào)胚胎7號(hào)染色體有26.12 Mb的缺失且遺傳了父親的羅氏易位衍生染色體為羅氏易位攜帶胚胎；2號(hào)胚胎14號(hào)染色體有82.99 Mb的缺失且為染色體不平衡胚胎；3號(hào)胚胎染色體數(shù)目正常且沒有遺傳到父親的羅氏易位衍生染色體，為正常胚胎；4號(hào)胚胎染色體數(shù)目正常且遺傳了父親樣本的羅氏易位衍生染色體，為羅氏易位攜帶胚胎。

2.213、14號(hào)染色體單體型構(gòu)建結(jié)果 父、母親與4個(gè)受檢胚胎13、14號(hào)染色體單體型構(gòu)建的結(jié)果見表2、3。遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的1號(hào)胚胎13號(hào)染色體上20個(gè)SNP位點(diǎn)與14號(hào)染色體上28個(gè)SNP位點(diǎn)信息與父親樣本的F1染色體相同；而同樣遺傳了羅氏易位衍生染色體F1的4號(hào)胚胎13號(hào)染色體上20個(gè)SNP位點(diǎn)與14號(hào)染色體上27個(gè)SNP位點(diǎn)信息與父親樣本的F1染色體相同；說(shuō)明1、4號(hào)胚胎的羅氏易位衍生染色體確實(shí)來(lái)源于父親。2號(hào)胚胎14號(hào)染色體只有1條染色單體，為染色體缺失；3號(hào)胚胎13號(hào)與14號(hào)染色體則遺傳了父母雙方的正常染色單體。

表1 4個(gè)胚胎的NGS結(jié)果匯總

表2 13號(hào)染色體單體型構(gòu)建結(jié)果

續(xù)表2 13號(hào)染色體單體型構(gòu)建結(jié)果

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號(hào)受檢胚胎；S17081801-2表示2號(hào)受檢胚胎；S17081801-3表示3號(hào)受檢胚胎；S17081801-4表示4號(hào)受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本13號(hào)染色體上的1號(hào)SNP位點(diǎn)到20號(hào)SNP位點(diǎn)；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰2個(gè)SNP的分隔符，均起到區(qū)分作用；“？”表示未知的結(jié)果或者是檢測(cè)到SND但無(wú)法確定

表3 14號(hào)染色體單體型構(gòu)建結(jié)

注：S17081801-F表示父親樣本；S17081801-M表示母親樣本；S17081801-1表示1號(hào)受檢胚胎；S17081801-2表示2號(hào)受檢胚胎；S17081801-3表示3號(hào)受檢胚胎；S17081801-4表示4號(hào)受檢胚胎；SNP_1～SNP_20表示受檢樣本14號(hào)染色體上的1號(hào)SNP位點(diǎn)到20號(hào)SNP位點(diǎn)；“：”和“|”分別表示父母樣本和子代樣本同一條染色體相鄰兩個(gè)SNP的分隔符，均起到區(qū)分作用；“？”表示未知的結(jié)果或者是檢測(cè)到SND但無(wú)法確定

3 討 論

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)是在體外受精-胚胎移植基礎(chǔ)上對(duì)卵母細(xì)胞或種植前胚胎進(jìn)行活檢，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)，選擇正常或遺傳表型正常的胚胎移植，從而有效降低流產(chǎn)率，提高活產(chǎn)率，避免選擇性終止妊娠。

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)主要包括PGS和PGD 2個(gè)方面，PGS是對(duì)胚胎23對(duì)染色體非整倍體異常、微缺失、微重復(fù)異常進(jìn)行篩查，選擇沒有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的胚胎進(jìn)行移植，有效降低早期流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，顯著提高臨床妊娠率。PGD是針對(duì)不同的病因在胚胎著床之前即對(duì)配子或胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的胚胎進(jìn)行移植，可有效阻斷家族遺傳病的垂直遺傳。

對(duì)染色體羅氏易位攜帶者進(jìn)行PGD檢測(cè)，目前已被報(bào)道的檢測(cè)技術(shù)主要包括熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、微陣列比較基因組雜交(aCGH)及NGS，這些檢測(cè)技術(shù)均在對(duì)染色體易位的檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，各有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，也均具有一定的局限性。

FISH技術(shù)曾是PGD主要的遺傳學(xué)方法之一，用以篩查染色體臂間倒位及易位，判定是否存在嵌合以及染色體異常[7]。其局限性主要表現(xiàn)在由于探針數(shù)量或染料種類的限制，F(xiàn)ISH技術(shù)無(wú)法全面檢測(cè)23對(duì)染色體[8]；2012、2013年波蘭學(xué)者LUKASZUK博士分別利用FISH技術(shù)和NGS作為技術(shù)手段對(duì)一對(duì)男方攜帶有14、15號(hào)染色體羅氏易位衍生染色體的夫婦進(jìn)行PGD檢測(cè)輔助生殖，2012年1月進(jìn)行FISH檢測(cè)挑選后移植，但由于FISH技術(shù)無(wú)法對(duì)染色體數(shù)目進(jìn)行全面篩查，所植入胚胎在第10個(gè)孕周時(shí)流產(chǎn)；2013年9月該團(tuán)隊(duì)取樣10枚囊胚期胚胎細(xì)胞，采用與本研究同樣的NGS檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)全基因組擴(kuò)增利用Ion PGM測(cè)序儀及其配套NGS試劑進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)分析結(jié)果挑選1枚健康胚胎移植，成功輔助夫婦誕下一名健康嬰兒[9]。說(shuō)明了NGS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)胚胎是否攜帶羅氏易位衍生染色體的同時(shí)還對(duì)染色體是否發(fā)生了非整倍體數(shù)目異常進(jìn)行檢測(cè)，首先排除會(huì)造成流產(chǎn)或先天性出生缺陷的染色體數(shù)目異常胚胎，實(shí)現(xiàn)更加全面的遺傳學(xué)檢測(cè)。

aCGH技術(shù)是與FISH相關(guān)、能篩查出胚胎染色體數(shù)目異常的檢測(cè)技術(shù)，但aCGH與本研究中應(yīng)用的NGS在篩查染色體數(shù)目異常的準(zhǔn)確率方面存在差異，2015年YANG等[10]采用NGS技術(shù)進(jìn)行了79例植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，采用aCGH進(jìn)行了78例植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，采用NGS檢測(cè)的流產(chǎn)率為1.3%，采用aCGH檢測(cè)的流產(chǎn)率為2.6%；2016年NISSON等[11]將NGS和aCGH進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果顯示，NGS準(zhǔn)確率為95%，aCGH準(zhǔn)確率為87%。故相對(duì)于FISH，本研究采用的達(dá)瑞生殖基于Ion PGM測(cè)序儀在胚胎活檢后進(jìn)行NGS的檢測(cè)方法在羅氏易位攜帶者檢測(cè)方面在實(shí)現(xiàn)更加全面的檢測(cè)同時(shí)在染色體數(shù)目異常檢測(cè)的準(zhǔn)確率方面優(yōu)于aCGH技術(shù)，且通過(guò)一個(gè)配套的實(shí)驗(yàn)流程，使用同一套儀器設(shè)備能同時(shí)達(dá)到染色體數(shù)目篩查和羅氏易位衍生染色體檢測(cè)的目的，讓PGD檢測(cè)更加全面、精確和便捷。

作為新型羅氏易位攜帶者PGD檢測(cè)技術(shù)，NGS本身也具有一定的局限性，如因單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)過(guò)程中可能存在的等位基因脫扣有可能造成誤診或漏診[12]。而本研究在NGS的數(shù)據(jù)分析中結(jié)合了核型分析的結(jié)果在13號(hào)染色體區(qū)域選了20個(gè)SNP位點(diǎn)、14號(hào)染色體區(qū)域上選取了28個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行家系單體型構(gòu)建，再通過(guò)SNP連鎖分析構(gòu)建4號(hào)受檢胚胎13、14號(hào)染色體的單體型，有效避免了等位基因脫扣對(duì)檢測(cè)結(jié)果判讀的影響；而在2017年XU等[13]采用同樣基于NGS檢測(cè)技術(shù)的等位基因映射識(shí)別攜帶者單體型技術(shù)對(duì)3對(duì)羅氏易位攜帶者夫婦的12例胚胎先后進(jìn)行羅氏易位攜帶者PGD檢測(cè)與分析，對(duì)特定區(qū)域選取了6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析來(lái)構(gòu)建單體型，其中2對(duì)夫婦各獲得1個(gè)健康胚胎，進(jìn)行植入后其中一對(duì)夫婦已成功誕下健康嬰兒，另一對(duì)夫婦成功得到妊娠，羊水穿刺顯示核型分析正常。與2017年XU等[13]研究結(jié)果比較，本研究在特定區(qū)域選取了更多的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，能更好地避免等位基因脫扣造成誤診的問題，令胚胎染色體單體型構(gòu)建可信度更高。

本研究采用WGA結(jié)合NGS和SNP連鎖分析，通過(guò)單體型的構(gòu)建可推斷胚胎2條DNA鏈的來(lái)源，從而最終確定其是否為正常胚胎。根據(jù)本研究4個(gè)胚胎的檢測(cè)結(jié)果，1、2號(hào)胚胎均存在染色體異常，經(jīng)構(gòu)建13、14號(hào)染色體單體型，進(jìn)一步進(jìn)行PGD檢測(cè)，鑒定1、4號(hào)胚胎均為羅氏易位攜帶者。由于羅氏易位衍生染色體攜帶者在表型上和正常核型的人并無(wú)差異[14]，往往因?yàn)槠渥优加心撤N疾病而確診[15]，沒有發(fā)生染色體數(shù)目變異的3、4號(hào)胚胎均為可正常出生和發(fā)育成長(zhǎng)的可移植胚胎；但羅氏易位攜帶者在生育時(shí)存在較高風(fēng)險(xiǎn)生出染色體異常的后代，3號(hào)胚胎由于沒有攜帶羅氏易位衍生染色體，故為優(yōu)質(zhì)胚胎。最后選擇核型正常且沒有致病基因攜帶的3號(hào)胚胎進(jìn)行植入，阻斷了羅氏易位衍生染色體的垂直遺傳，有利于優(yōu)生優(yōu)育。

目前，國(guó)內(nèi)外均可見到NGS用于PGS/PGD的文獻(xiàn)報(bào)道，但由于當(dāng)下PGS、PGD需對(duì)胚胎細(xì)胞進(jìn)行活檢取樣，這個(gè)過(guò)程對(duì)胚胎本身的損傷也備受爭(zhēng)議。近年來(lái)，對(duì)PGS和PGD的部分文獻(xiàn)還報(bào)道了其存在子代安全性[16]及后天發(fā)育的問題[17]，但目前缺乏這方面的樣本積累及研究。近年來(lái)，無(wú)創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)已興起，該技術(shù)應(yīng)用游離在胚胎培養(yǎng)液中的微量DNA通過(guò)單細(xì)胞全基因擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎染色體的全面篩查[18]，將從胚胎上提取細(xì)胞的活檢形式改成從培養(yǎng)液中提取DNA，保留了胚胎樣本的完整性。相信隨著科技的進(jìn)步，PGS和PGD會(huì)用于各種生殖遺傳疾病方面的檢測(cè)，對(duì)羅氏易位攜帶者的PGD技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟和可靠。