牛磺酸對脂多糖誘導小鼠急性腎損傷的保護作用及機制*

許明賢， 曹舒晴， 董偉, 任卉芳， 許厲風， 秦理璐， 鐘祎

廣州醫(yī)科大學基礎學院生理教研室(廣東廣州 511436)

革蘭陰性細菌產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)是一種重要的致炎因子,可導致膿毒癥甚至多器官功能障礙綜合征[1]，腎臟是首要的靶器官。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上的常見危重疾病，由LPS所導致的膿毒癥是引起AKI的重要常見病因[2]，膿毒癥并發(fā)AKI時病情兇險，病死率高[3]。?；撬?Taurine, Tau)是一種β-氨基乙磺酸，在體內以游離狀態(tài)存在，具有抗氧化、抗炎等多種生物學效應。國內外的大量研究顯示牛磺酸對肝、腦、腎等器官損害具有保護作用[4-11]。2017年3月至2018年7月我們開展實驗，研究?；撬釋PS誘導的小鼠AKI的保護作用，并從氧化應激、炎癥反應兩方面探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 SPF級KM雄性小鼠[體重(36±3)g，購于中山大學實驗動物中心]。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，丙二醛 (MDA)測試盒，肌酐(Cr)測試盒，血尿素氮(BUN)測試盒，尿蛋白定量測試盒均購于南京建成生物工程研究所。小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。LPS(sigma)購于合肥博美生物科技有限責任公司。?；撬?純度99%，食品級)購于湖北省潛江永安藥業(yè)股份有限公司。

1.2 動物模型制備 30只KM小鼠隨機分為3組(n=10)：假手術組、模型組(LPS組)和治療組(?；撬?LPS組)；腹腔注射LPS(10 mg/kg)方法復制小鼠AKI模型[12-13]，假手術組注射同樣劑量生理鹽水，治療組于術前7 d開始用?；撬崛芤?0.2 g/0.2 mL)灌胃, 1次/d， 持續(xù)8 d， 正常飼食。

1.3 血尿生化指標的檢測 眼球取血，分離血清測定BUN、血肌酐(Scr)、MDA含量、SOD活性和GSH-Px。留取造模后24 h尿液，按照試劑盒說明書檢測BUN、尿蛋白和尿肌酐(Ucr)的含量。

1.4 腎組織HE染色和細胞因子檢測 取小鼠雙側腎臟，冰生理鹽水洗去血液，用濾紙吸去表面水分，稱重并計算小鼠腎臟系數(shù)(腎臟質量/小鼠體重)。隨后取部分腎臟，加入冰生理鹽水，冰上勻漿，低溫離心并取上清液檢測TNF-α和IL-1β的濃度，余下部分置于Bouin液防腐，用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色切片，顯微鏡下觀察腎組織損傷情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，不同實驗組小鼠的腎功能生化指標、氧化應激指標和炎性因子表達的組間差異用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用 Duncan 氏法進行多重比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牛磺酸改善腎功能和腎組織受損 與假手術組比，模型組小鼠尿液和血清中BUN和Cr水平明顯增加，尿蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，出現(xiàn)腎功能下降。腎組織切片顯示，模型組腎小管上皮細胞變性壞死，腎間質充血水腫并有炎細胞浸潤，腎小球可見中性粒細胞浸潤及纖維素滲出(圖1-A、B)，腎系數(shù)增加，腎組織出現(xiàn)實質性損傷。與模型組相比，牛磺酸治療組能明顯改善腎功能下降和腎組織受損情況(圖1-C)。見表1。

組別BUN(mmol/L)Ucr(μmol/L)尿蛋白(mmol/L)血清BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)腎系數(shù)(%)假手術組 309.96±9.541.76±0.491.14±0.315.38±1.6315.12±3.251.04±0.14模型組537.72±15.68?5.83±0.57?2.76±0.41?43.75±5.26?56.49±6.57?1.58±0.21?治療組272.93±17.46#2.04±0.68#1.42±0.18#7.75±2.39#27.41±4.28#1.23±0.12#

*與假手術組比較P<0.05; #與模型組比較P<0.05

A:假手術組；B:模型組；C:治療組

2.2 ?；撬峤档湍Ｐ徒M小鼠血清中MDA含量，并增加SOD、GSH活力 與假手術組比，模型組小鼠血清中MDA含量增加，SOD和GSH活力下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別血清MDA(nmol/L)血清SOD活力(U/mL)血清GSH(U/mL)假手術組5.21±0.8715.55±2.1258.65±3.65模型組10.97±1.67?9.45±1.02?34.19±4.21?治療組6.25±1.48#13.21±1.34#70.68±3.84#

*與假手術組比較P<0.05; #與模型組比較P<0.05

2.3 ?；撬峤档湍Ｐ徒M小鼠腎組織TNF-α和IL-1β含量 與假手術組比，模型組小鼠腎組織TNF-α和IL-1β含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

組別腎組織TNF-α(pg/L)腎組織IL-1β(pg/mL)假手術組32.59±1.8533.49±2.14模型組59.12±2.96?64.28±2.68?治療組40.22±2.58#40.57±3.21#

*與假手術組比較P<0.05; #與模型組比較P<0.05

3 討論

由LPS引起的全身炎癥所造成的AKI是臨床上常見的危重疾病，病情兇險，病死率高。然而AKI產(chǎn)生的機制并不十分明確，臨床上也缺乏有效的治療手段。牛磺酸是一種β-氨基乙磺酸，在體內以游離狀態(tài)存在，具有抗氧化、抗炎等多種生物學效應[12]。大量研究顯示，?；撬岵粌H對肝、腦等器官損傷有保護作用[4-6]，而且對多種原因如百草枯[7]、糖尿病[8]、缺血再灌注[9]、體外沖擊波碎石[10]、藥物中毒[11]等造成的AKI有保護作用，然而在LPS引起的AKI中，牛磺酸是否也有保護作用，其機制如何，還沒有文獻報道。

本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS可導致小鼠腎功能下降、腎系數(shù)增加、腎組織損傷；連續(xù)?；撬峁辔附o藥明顯改善腎功能，表現(xiàn)為血清中BUN和Scr含量下降，尿液中BUN、Cr和尿蛋白含量下降，這些結果提示口服牛磺酸可明顯改善LPS引起的腎功能損傷。

大量文獻表明，LPS引起AKI的機制與自由基的產(chǎn)生、脂質過氧化和炎癥反應有重要關系[13-14]?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。自由基可使細胞膜被破壞、血清抗蛋白酶失去活性、損傷基因導致細胞變異的出現(xiàn)和蓄積。過多的活性氧可通過生物膜中多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生脂質過氧化物，引起細胞的膜性損傷以及線粒體損傷，從而產(chǎn)生更多的活性氧，造成惡性循環(huán)[15-16]。MDA 是體內脂質過氧化的重要產(chǎn)物，可間接反映脂質過氧化程度，是評價氧化應激水平的重要指標[17]。正常生理情況下，機體存在一些抗氧化物維持機體氧化/還原平衡，主要包括SOD、 GSH、 GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)和維生素E/C等[18]。SOD 能清除氧自由基，是最重要的超氧自由基清除因子，它通過使氧自由基發(fā)生歧化反應，把超氧自由基轉化為過氧化氫，并進一步轉化為水，其活力的高低反映了抗氧化和防御自由基損傷的能力[17-18]。?；撬嵬ㄟ^降低肝組織MDA含量、提高GSH活力改善缺血再灌注造成的肝損傷[19], ?；撬嵬ㄟ^降低心肌組織MDA含量、增加SOD活力改善心肌缺血引起的損傷[20]。本研究顯示連續(xù)?；撬峤o藥可明顯降低血清中MDA的含量，并提高血清中SOD和GSH活力，表明?；撬峥赡芡ㄟ^對抗或者清除自由基減輕LPS引起的腎損傷。

LPS通常與機體內的細胞膜上Toll樣受體結合，通過激活細胞內NF-κB信號通路，誘導細胞過量表達和分泌TNF-α、IL-1β等致炎細胞因子，從而引起局部組織細胞變性、壞死[21-22]。本研究結果顯示，LPS處理的小鼠腎組織炎癥細胞因子IL-1β及TNF-α明顯升高；腎組織HE染色結果表明腎組織出現(xiàn)明顯病理損傷，且有較多炎癥細胞浸潤。?；撬犷A處理可降低腎組織IL-1β和TNF-α的含量，改善組織損傷。以上結果提示?；撬峥赡芡ㄟ^抑制炎性反應減輕LPS引起的腎損傷。

綜上所述，進行?；撬犷A處理對LPS誘導的膿毒癥小鼠AKI有一定保護作用，其機制與牛磺酸對抗氧化應激和抑制腎臟炎性反應有關。