GRAP和Treg在胃癌中的表達及與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系*

李亦明， 鐘碧玲， 曾伍姣， 權(quán)莉， 龍中華， 王貴明

廣東省第二人民醫(yī)院病理科(廣東廣州 510317)

胃癌是世界上分布最廣泛的第四大腫瘤，也是目前世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因，特別是進展期胃癌的生存率較低，因為在大多數(shù)情況下，胃癌患者診斷多已處于晚期，診斷時多為進展期或合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此患者預(yù)后往往較差[1-2]。手術(shù)仍然是該病在手術(shù)階段唯一比較有效的治療方法[3]，而晚期胃癌的化療對改善患者預(yù)后發(fā)揮重要作用。免疫應(yīng)答在胃癌中的作用目前仍未明確，但最近的研究表明化療可能引發(fā)免疫反應(yīng)，這可能有助于治療。以前的研究[4]表明，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)在惡性腫瘤的免疫應(yīng)答中被認為起著至關(guān)重要的作用,同時TILs在胃癌中的預(yù)后意義取決于TILs的密度和類型。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)是一種在免疫逃逸中起主要作用的免疫抑制性T淋巴細胞，其能抑制免疫系統(tǒng)抗腫瘤的反應(yīng)，從而促進腫瘤的生長和侵襲[5]。FOXP3是一種調(diào)節(jié)Treg發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，被認為是Treg的標(biāo)志物。然而，最近的研究表明，F(xiàn)OXP3不能用作Treg的可靠標(biāo)記，且效應(yīng)T細胞在活化后也會上調(diào)FOXP3的表達。糖蛋白A為主重復(fù)序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP)僅在活化的Treg中選擇性表達，而不在活化的效應(yīng)T細胞中選擇性表達[6]，表明GARP對Treg進一步分類標(biāo)記的靶標(biāo)[7]。本研究旨在探討GARP+Treg在胃癌中的及其與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年6月因胃癌于我院行手術(shù)治療患者共124例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診為胃癌的患者；(2)臨床資料完整；(3)病理資料完整；(4)獲得完整隨訪的患者。排除合并機體免疫性疾病或失訪的患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會評估審核批準(zhǔn)。124例胃癌患者中男69例，女55例，年齡34～83歲，平均(54.2±8.3)歲，其中TNM分期為Ⅰ期23例，Ⅱ期65例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例。

1.2 免疫組化 本研究中使用常規(guī)的鏈霉親和素過氧化物酶免疫組織化學(xué)(IHC)染色方案進行。將石蠟包埋的胃癌組織塊用萊卡切片機切成4 μm厚的蠟片，每例用防脫載玻片撈片2張，分開兩組裝架，每組有相同病例載玻片124片，然后將其放進70℃烤箱烤片60 min后，用二甲苯脫蠟并過梯度酒精至蒸餾水。用1%過氧化氫處理組織切片10 min以阻斷內(nèi)源性組織過氧化物酶，隨后用牛血清處理30 min以減少非特異性結(jié)合。然后，使用檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)進行抗原修復(fù)，具體步驟如下：高熱微波處理5 min，接著低熱微波處理20 min。組一的所有載玻片滴加兔抗人FOXP3單克隆抗體(#12653,1∶200稀釋;CST公司)作為Treg的標(biāo)記，組二載玻片滴加兔抗人GARP多克隆抗體(bs-12093R,1∶200稀釋度，北京博奧森)，兩組載玻片均一抗4℃下過夜孵育，然后用生物素標(biāo)記二抗孵育1 h后，所有載玻片用磷酸鹽緩沖液(pH=7.4的PBS)沖洗，用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺底物試劑盒顯色，然后用蘇木精復(fù)染載玻片。

1.3 免疫組化評估方法 由2位臨床病理醫(yī)師采用奧林巴斯(BX53)顯微鏡下對切片進行評估，結(jié)果取平均值。用FOXP3和GARP抗體在淋巴細胞中進行細胞質(zhì)染色被定義為陽性。每切片由臨床病理師隨機選5個高倍視野(×200)，計算平均每個視野FOXP3+Treg和GARP+Treg的陽性細胞數(shù)，最后每例切片的結(jié)果取2位病理醫(yī)師的平均值，124例患者的中位FOXP3+Treg和GARP+Treg的陽性細胞數(shù)分為低表和高表達組，其中124例患者FOXP3+Treg的中位陽性細胞數(shù)為17個/高倍鏡；GARP+Treg的中位陽性細胞數(shù)為14個/高倍鏡。

1.4 臨床指標(biāo)評價 記錄所納入124例胃癌患者的年齡、性別、腫瘤分化情況、浸潤深度、TNM分期，是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，對比FOXP3+Treg和GARP+Treg高表達和低表達與各項臨床特征的關(guān)系，記錄所有患者隨訪的生存情況。

2 結(jié)果

2.1 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌組織中的表達情況 124例胃癌患者的腫瘤組織中平均FOXP3+Treg陽性細胞數(shù)為(17.2±7.8)個/高倍鏡，而平均GARP+Treg陽性細胞數(shù)為(13.9±5.3)個/高倍鏡，胃癌組織中FOXP3+Treg陽性細胞數(shù)顯著高于GARP+Treg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.897,P<0.001)，見圖1。

A：胃癌FOXP3+ Treg低表達；B：FOXP3+ Treg在胃癌組織中高表達；C：GARP+ Treg在胃癌組織低表達；D：GARP+Treg在胃癌組織中高表達

圖1FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌組織中的表達情況(免疫組化，×200)

2.2 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌中的表達與臨床特征的關(guān)系 FOXP3+ Treg和GARP+Treg與胃癌患者的性別、年齡、分化程度沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)，而TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的FOXP3+Treg和GARP+Treg高表達患者比例顯著增高(P<0.05)，F(xiàn)OXP3+Treg和GARP+Treg的表達比例具有顯著的相關(guān)性(P<0.001)，見表1。

2.3 FOXP3+Treg和GARP+Treg對胃癌預(yù)后的影響 124例胃癌患者隨訪時間為6～47個月，中位隨訪時間為35個月， 其中FOXP3+Treg高表達的患者其總體生存率顯著低于FOXP3+Treg低表達的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=2.228，95%CI：1.070～4.638，P=0.032)；且GARP+Treg高表達的患者其總體生存率顯著低于GARP+Treg低表達的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=3.152，95%CI：1.514～6.566，P=0.002)。見圖2。

表1 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌中的表達與臨床特征的關(guān)系 例

A:FOXP3; B:GARP

3 討論

研究表明存在許多表面和細胞內(nèi)分子在Treg中高度表達，也有一些分子在Treg上表現(xiàn)出低或負表達[8]。由于目前Treg的可靠標(biāo)記物仍然有限，所以在免疫治療中對Treg的表達監(jiān)測仍然具有障礙[9]。GARP是由662個氨基酸組成的跨膜蛋白。高度表面活化的Treg上GARP的表達顯著增加，并增加Treg的抑制功能。此外，GARP可以與潛在的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)結(jié)合，從而促進TGF-β的分泌和活化[9]。TGF-β對Treg的穩(wěn)態(tài)和功能起著決定性的作用。目前Treg的主要標(biāo)記物為FOXP3，已有研究[10]表明FOXP3+Treg在腫瘤組織周圍的積聚可通過其在許多癌癥中的免疫抑制功能促進腫瘤生長或明顯轉(zhuǎn)移。既往研究[11]表明，Treg對化療敏感，化療的抗腫瘤活性導(dǎo)致Treg的消耗，從而影響FOXP3+Treg數(shù)量減少，除Treg外，F(xiàn)OXP3在非Treg和效應(yīng)T細胞中均存在表達，因此FOXP3并不是標(biāo)記Treg的最佳標(biāo)志物[12]。因此，本研究探討GARP+Treg在胃癌中的表達與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的FOXP3+Treg和GARP+Treg高表達患者比例均顯著增高，進一步顯示了FOXP3+Treg和GARP+Treg的表達具有顯著的相關(guān)性。表明了采用GARP對Treg進行標(biāo)記具有良好的標(biāo)記效果。目前研究[13]顯示GARP和Foxp3之間的關(guān)系仍在爭論中。Foxp3的表達對于GARP的表達似乎不是必需的，因為在Treg中沉默F(xiàn)oxp3的表達后并不顯著影響GARP的表達水平[14]。沉默GARP僅減弱Treg抑制活性，也不影響Foxp3的表達。沉默F(xiàn)oxp3不會改變GARP + Treg的抑制功能[15]。Treg中GARP的誘導(dǎo)依賴于Foxp3表達，并且GARP也可以誘導(dǎo)Foxp3表達。此外，在T細胞受體(TCR)激活后，無論Foxp3表達如何，GARP/LAP都在CD4+Helios+T細胞上調(diào)節(jié)[16]。這些表明GARP和Foxp3的表達可能是獨立的。

既往研究[17]顯示了GARP在Treg功能中的潛在作用，GARP+Treg分泌更少的IL-2和IFN-γ。GARP+Treg能夠分泌大量的TGF-β和IL-10。此外，Treg的抑制功能受到GARP下調(diào)的影響。這些結(jié)果表明，GARP至少部分增加了Treg的免疫抑制功能，但是GARP介導(dǎo)的Treg抑制機制仍有待進一步研究[18]。本研究結(jié)果進一步顯示了高表達FOXP3+Treg和GARP+Treg的胃癌患者其預(yù)后不良，表明了兩種標(biāo)記都能具有作為潛在靶標(biāo)的能力，但GARP+Treg高表達更顯著，表明GARP+Treg可能更能反映Treg的功能。GARP是活化Treg的潛在TGF-β的受體，并且在活化的FOXP3+Treg中高表達以促進免疫抑制。GARP有效地抑制幼稚CD4+T細胞的增殖和分化為 T效應(yīng)細胞[19]，證明GARP在Treg成熟和功能中起關(guān)鍵作用。因此，GARP+Treg是晚期胃癌的獨立預(yù)后因子，也間接證明了GARP+Treg是具有免疫抑制特性的真正Treg。

綜上所述， GARP+Treg與胃癌患者的TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)， 胃癌組織中GARP+Treg的高表達是胃癌患者不良預(yù)后的風(fēng)險因素。然而，本研究為單中心研究，樣本含量有限，相關(guān)結(jié)論有待進一步驗證。