甘露醇磷酸化酶基因的敲除對D-甘露醇合成的影響

趙雅童 何光明 甕茹茹 石愛琴 路福平 李玉

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 工業(yè)微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

甘露醇作為一種功能性糖醇，因其甜度和生理熱量值均較低，且生理代謝不需要胰島素等優(yōu)點，可作為甜味劑供糖尿病人使用，也可防止牙齒齲變、可用作矯味劑和用于烘烤食品等［1-2］。在國際上，食品添加劑聯合專家委員會（JECFA）和美國FDA食品添加劑法規(guī)均規(guī)定在食品工業(yè)上可以使用甘露醇［3］。目前，工業(yè)生產甘露醇的方法主要仍采用海藻提取法和化學氫化法，而利用微生物發(fā)酵法生產甘露醇研究較多的是乳酸菌，但因乳酸菌培養(yǎng)要求較高和難以實現高密度培養(yǎng)，導致生產成本較高，仍未實現工業(yè)化生產。

目前已通過基因工程手段對產甘露醇的相關酶進行過量表達或敲除菌株中副產物的生成途徑，構建了許多以大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等作為宿主的生產甘露醇的重組菌株［4］。Gaspar等［5］構建了一株可以高效將葡萄糖轉化為甘露醇的甘露醇轉運突變菌。2005年，Kaup等［6-8］在大腸桿菌中異源表達胞外葡萄糖異構酶使葡萄糖轉化為甘露醇。在此基礎上，共表達了來源于大腸桿菌的xylA基因和葡萄糖異構酶，其能利用葡萄糖生成甘露醇。同時，在大腸桿菌中構建重組氧化/還原循環(huán)，使其能夠從果糖生成甘露醇。結果表明，重組大腸桿菌可作為D-甘露醇合成的有效生物催化宿主。目前，關于D-甘露醇生成的研究大多集中于不同底物的轉化和輔因子循環(huán)體系的構建，關于其他因素對甘露醇合成的影響研究目前較少。

為了進一步研究影響甘露醇合成的因素，結合KEGG中列出的大腸桿菌K-12的代謝途徑可知，甘露醇可作為一種次級碳源被大腸桿菌所利用，導致生成的甘露醇會被菌體自身所分解利用，所以欲阻斷甘露醇的分解途徑，以實現甘露醇的積累。旨在選取來源于布氏乳桿菌（Lactobacillus brevis）的甘露醇脫氫酶基因，構建了合成甘露醇的重組菌株，在此基礎上，主要針對大腸桿菌中甘露醇的分解途徑進行研究，對該途徑的關鍵基因進行敲除，探究基因敲除后菌株的生長以及菌株利用甘露醇能力的變化，旨在為研究大腸桿菌合成甘露醇的代謝調控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株L. brevis（用于甘露醇脫氫酶基因mdh的獲得）、E. coliDH5α（用于重組質粒的構建）、E.coliK-12（用于重組質粒的表達）、克隆表達載體pTrc99a、克隆載體pMD19-T simple 均為本實驗室保存。用于基因敲除的質粒pGRB和pRedCas9均由天津大學陳濤老師課題組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，檸檬酸三銨2.0，CH3COONa 5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐溫 -80 1 mL，用于L. brevis于37℃培養(yǎng)，在MRS液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉后為MRS固體培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基，用于大腸桿菌于37℃下培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉后為固體培養(yǎng)基。當在固體或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體需要添加氨芐青霉素時，其終濃度為100 mg/L；需要添加奇霉素時，其終濃度為25 mg/L。

1.1.3 試劑 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素、奇霉素、還原型輔酶Ⅱ二鈉鹽（NADH）等均購于Sigma公司；Taq DNA聚合酶、solution I 連接酶、限制性內切酶EcoRI和HindIII、同源重組酶ClonExpress均購于TaKaRa公司；DNA分子量標準、DNA 純化回收試劑盒、質?？焖偬崛≡噭┖泻偷鞍踪|分子量標準等均購于上海生物工程有限公司；PCR引物均由北京華大基因技術有限公司合成；克隆載體pMD19-T simple購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 按參考文獻［9］所述方法提取L. brevis總基因組DNA。根據GenBank報道的L.brevisATCC 367中甘露醇脫氫酶基因（mdh）全序列進行引物設計，見表1。用限制酶分別對擴增后的甘露醇脫氫酶基因片段和載體pTrc99a進行雙酶切，構建重組質粒pTrc99a-mdh，通過氨芐青霉素抗性平板篩選轉化子，然后分別使用雙酶切法和PCR驗證法對轉化子質粒進行鑒定。

1.2.2 對目的蛋白進行表達及SDS-PAGE分析 分別按2%接種量轉接含有R1和R0的種子液至200mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達到0.8-1.0時，用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達結果。

1.2.3 酶活的測定 參見文獻［10］所述方法測定甘露醇脫氫酶的酶活。酶活計算公式為：

1.2.4 甘露醇的檢測 分別挑取單菌落接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃條件下、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。再按2%的接種量，將過夜培養(yǎng)物接種于50 mL的液體LB培養(yǎng)基中。對相應發(fā)酵液進行誘導表達，后進行菌體離心，收集上清液進行高效液相色譜檢測。

用高效液相色譜分析底物與產物的含量變化。色譜條件：Prevail Carbohydrate ES色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動相乙腈∶水=75∶25；柱溫30℃；流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器。以溶液濃度為橫坐標，峰面積的對數值為縱坐標，繪制標準曲線，并得到回歸方程。

1.2.5 利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術對大腸桿菌進行基因敲除 以菌株K-12為出發(fā)菌株，敲除甘露醇磷酸轉移酶編碼基因中的IIA、IIB和 IIC 元件cmtA、cmtB和甘露醇磷酸轉移酶編碼基因mtlA。構建用于基因敲除的質粒pGRB-sgRNA：將由華大公司合成的sgRNA片段（表2）與經反向PCR獲得的pGRB質粒進行連接，利用熱激法將重組質粒pGRB-sgRNA轉入大腸桿菌DH5α，通過氨芐青霉素抗性平板篩選轉化子。

構建用于基因敲除的打靶片段：以野生型大腸桿菌K-12基因組為模板，分別用兩對引物cmtAcmtB- up-1/2、cmtAcmtB- down-1/2（表 1）擴增靶基因cmtA和cmtB的上下游同源臂，將兩個片段進行重疊PCR得到線性目的片段。利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術［11］對大腸桿菌進行基因敲除，對篩選得到的轉化子進行菌落PCR鑒定。

1.2.6 菌株生長曲線的測定 分別挑取單菌落到5mL LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，按2% 接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔30 min測定吸光值OD600，重復3次，繪制菌株的生長曲線。

表1 基因敲除及異源表達所用引物

表2 基因敲除所用sgRNA序列

1.2.7 測定基因敲除重組菌對甘露醇的利用能力 分別以葡萄糖和甘露醇作為唯一碳源，以及以葡萄糖和甘露醇按1∶1的比例作為混合碳源，通過測定 OD600的吸光值測定出發(fā)菌株和突變菌株對甘露醇的利用情況。

圖1 重組質粒pTrc99a-mdh雙酶切及PCR驗證電泳圖

2 結果

2.1 甘露醇脫氫酶重組質粒的構建及鑒定

將重組質粒經EcoRI和HindIII雙酶切鑒定轉化子，大小約為1 000 bp左右的小條帶為目的基因，大小約為4 000 bp左右的大片段為pTrc99a載體，結果如圖1-A所示，再次進行PCR驗證，片段為1 000 bp，與預計大小相符，結果如圖1-B所示，表明目的基因已插入到pTrc99a載體中，得到重組質粒pTrc99a-mdh。

2.2 目的蛋白的表達及酶活分析

將目的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析后得到的結果如圖2所示，大小約為36.8 kD，目的蛋白得以表達，與預測相同。同時對重組酶進行酶活的測定，酶活達到173 U/mL。

圖2 SDS-PAGE分析蛋白純化情況

2.3 甘露醇的轉化檢測

由于果糖進入大腸桿菌細胞時會發(fā)生磷酸化，成為果糖-6-磷酸，不能被甘露醇脫氫酶催化合成甘露醇，因此我們采用細胞破碎液進行轉化，添加果糖作為底物進行轉化，收集轉化后的上清液，通過HPLC法對其進行分析，同時也對胞外的發(fā)酵液進行檢測，在發(fā)酵體系中均不能檢測到果糖和甘露醇的存在，說明重組菌株R1不能積累甘露醇。

2.4 甘露醇分解途徑的阻斷及相關酶的功能分析

2.4.1 重組菌株R2的構建 以菌株K-12為出發(fā)菌株，敲除基因cmtA、cmtB，首先擴增靶基因的上下游同源臂，所得PCR產物大小分別均為600 bp，結果如圖3-A所示。將兩個片段進行重疊PCR得到線性目的片段，大小為1 200 bp，結果如圖3-B所示。經菌落PCR鑒定重組質粒pGRB-sgRNA轉化子，所得片段大小為600 bp，與預期一致，結果如圖3-C所示，表明sgRNA已插入到pGRB載體中。而后將核酸酶Cas9表達質粒、打靶片段和sgRNA重組質粒pGRB-sgRNA電轉化入感受態(tài)細胞中，對篩選得到的轉化子進行菌落PCR鑒定，出發(fā)菌株K-12驗證引物間的大小應為3 033 bp，而發(fā)生基因敲除和同源重組后的菌株，其驗證引物間的大小應為1 200 bp，條帶大小均與預期大小相符，結果如圖3-D和圖3-E所示，說明靶基因被成功敲除，最終可獲得菌株R2。

2.4.2 重組菌株R4的構建 再次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對大腸桿菌R2進行基因敲除，對篩選得到的轉化子進行菌落PCR鑒定，出發(fā)菌株R2驗證引物間的大小應為3 114 bp，而發(fā)生基因敲除和同源重組后的菌株，其驗證引物間的大小應為1 200 bp，條帶大小均與預期大小相符，結果如圖4所示，說明靶基因被成功敲除，最終可獲得菌株 R4（所有重組菌株如表3所示）。

圖3 cmtA、cmtB基因敲除元件的構建及結果驗證

圖4 mtlA基因敲除元件的構建及結果驗證

2.4.3 重組菌株的酶活分析 對重組菌株進行酶活的測定，結果如表4所示。

表3 菌株列表

表4 重組菌株的酶活測定

2.5 cmtA、cmtB、mtlA基因敲除對重組菌株生長的影響

分別測定重組菌株R3、重組菌株R5與出發(fā)菌株R1在 LB培養(yǎng)基中的生長曲線。結果如圖5-A所示，與出發(fā)菌株 R1相比，菌株R3的生長情況基本不受影響，二者的生長曲線基本重合；而菌株R5比出發(fā)菌株R1的生長速率低，長勢弱，說明將3個基因全部敲除后，生長受到了微弱影響。

圖5 菌株R1、R3、R5生長曲線及利用甘露醇的能力比較

2.6 重組菌株對葡萄糖及甘露醇的利用能力

甘露醇能夠作為碳源被菌體利用，將大腸桿菌PTS系統(tǒng)中的cmtA、cmtB和mtlA敲除后，菌株不能對甘露醇進行磷酸化，則菌株無法再利用其進行生長。因此我們測定了菌株 R3、R5和出發(fā)菌株 R1對葡萄糖及甘露醇的利用情況，以葡萄糖作為唯一碳源測定生長曲線，結果如圖5-B所示，3株菌株對葡萄糖的利用情況基本一致，基因敲除對菌株利用葡萄糖的能力沒有影響；以葡萄糖和甘露醇作為混合碳源測定生長曲線，結果如圖5-C所示，3株菌株的生長趨勢出現差距，R1最快，R5最慢，先進入穩(wěn)定期，原因可能是由于葡萄糖被利用后，敲除菌株無法利用甘露醇而進入穩(wěn)定期；以甘露醇作為唯一碳源時，結果如圖5-D所示，R5基本沒有生長，說明敲除菌株已無法利用甘露醇作為碳源進行生長。實驗表明，cmtA、cmtB、mtlA基因全部敲除后，菌株利用甘露醇的途徑已被阻斷。

2.7 甘露醇的轉化檢測

按照1.2.4的方法對菌株R1、R3、R5的轉化后上清液進行產物分析，結果如表5和圖6所示，在發(fā)酵體系中能夠檢測到果糖和甘露醇的存在；說明重組菌株R5能夠轉化果糖生成甘露醇，并使甘露醇得以積累。

表5 胞外甘露醇的合成量

圖6 底物和產物的液相色譜分析

3 討論

目前，運用基因工程的方法構建產甘露醇的菌株時，對其輔酶再生體系進行優(yōu)化。但甘露醇的生產是一種較為復雜的過程，仍有其他的因素會對其產生影響。之前，已有蔡友華等［12］構建了一株敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因的大腸桿菌，成功沉默了肌苷水解為次黃嘌呤的途徑，提高了酶催化的轉化率和5'-磷酸化肌苷的純度，降低了肌苷的損耗和生產成本。邱磊［13］敲除了球孢白僵菌的磷酸化酶基因Cdc25，使其在細胞周期、菌絲分隔方式及形態(tài)以及影響隔膜形成的若干效應基因的轉錄水平方面都發(fā)生了不同方向的改變。而大腸桿菌自身含有可使甘露醇發(fā)生磷酸化的基因。所以，我們考慮甘露醇的磷酸化是使大腸桿菌不能積累甘露醇的一部分原因。

對異源表達的酶進行優(yōu)化是目前的研究熱點之一。之前也已有程雅韻等［14］、Liu 等［15］和 Wang等［16］利用大腸桿菌異源表達甘露醇脫氫酶，可利用表達后的酶實現將果糖轉化為甘露醇的實驗，但表達的酶活力較低，轉化率也較低。王芳［17］和陳艷等［9］利用大腸桿菌表達L. brevis來源的甘露醇脫氫酶，實現了D-甘露醇的合成。而后，封志媚等［18］利用大腸桿菌表達來源于G. oxydans的甘露醇脫氫酶基因，酶活力達到270 U/mL，轉化率達到97.4%。所以，我們考慮對該異源表達的酶進行優(yōu)化，使重組菌株生產甘露醇的產量得以進一步提高。

而本研究中選用了以NADH為輔酶型的甘露醇脫氫酶基因，以使D-果糖轉化為D-甘露醇，此過程需要一定的輔酶使其完成。目前已有文獻報道，在大腸桿菌中，異源表達甘露醇脫氫酶、甲酸脫氫酶基因，構建一個NADH循環(huán)再生體系，實現D-果糖到D-甘露醇的細胞轉化［8，19］。例如，將來源于Leuconostoc pseudomesenteroidesATCC 12291的甘露醇脫氫酶基因（mdh）和來源于Mycobacterium VCtCCaPN10的甲酸脫氫酶在大腸桿菌中進行共表達，而甲酸在甲酸脫氫酶和NAD+的作用下脫氫變成二氧化碳，NAD+還原形成NADH，最終重組大腸桿菌細胞能夠生成D-甘露醇［19-20］。結合目前的研究熱點，我們將在本研究的基礎上，對該重組菌株進行進一步的構建與優(yōu)化，為進一步探究甘露醇的大腸桿菌合成菌株奠定基礎。

4 結論

本研究以目前研究透徹、遺傳背景清晰、非病原性的大腸桿菌作為研究模型，敲除了大腸桿菌PTS系統(tǒng)中分解利用甘露醇途徑的三個基因cmtA、cmtB、mtlA，獲得突變菌株R4，發(fā)現其生長速率明顯下降且菌株已無法利用甘露醇進行生長，說明大腸桿菌對甘露醇的分解途徑已被完全阻斷。構建了重組菌株R5，表達后測得酶活力為258 U/mL，在發(fā)酵體系中能夠檢測到果糖和甘露醇的存在，說明重組菌株能夠轉化果糖生成甘露醇，并使甘露醇得以積累。