背角無齒蚌σ-GST基因克隆與五氯酚脅迫表達分析

夏西超 劉慶春 華春秀 張科 李冰潔 宋國英 薛士鵬 于瑞雪王中曉 張慶遠 劉麗

（1. 平頂山學院醫(yī)學院，平頂山 476000；2. 南陽醫(yī)學高等?？茖W校基礎醫(yī)學部，南陽 473061）

谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）屬于機體II相生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酶類，能夠催化谷胱甘肽與各種不溶的外源性或內(nèi)源性有毒化合物等親電子物質(zhì)發(fā)生共扼反應，并將其轉(zhuǎn)化成可溶性的無毒物質(zhì)從而排出體外［1-2］。GSTs在生命活動過程中具有解毒、抗氧化等保護細胞的作用，而且對污染物脅迫效應敏感［1-2］。研究表明，GSTs表達可以被重金屬、殺蟲劑、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、四丁基錫和雌激素和多溴聯(lián)苯醚等外源性物質(zhì)誘導，常作為潛在生物指標物和環(huán)境健康評估早期預警靶分子［1-2］。在哺乳動物中，根據(jù)GSTs底物特異性、免疫學性質(zhì)和蛋白質(zhì)序列的同源性，把GSTs劃分為α、μ、π、θ、σ、ζ和ω等7個大類［3］。軟體動物作為動物王國重要類群之一，目前已經(jīng)從九孔鮑（Haliotis diversicolor）、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、 紫 貽 貝（Mytilus edulis）、 圓 蛤（Mercinaria mercinaria）、凸頂珠蚌（Unio mmidus）、河 蜆（Corbicula fluminea）、 三 角 帆 蚌（Hyriopsis cumingii）、褶紋冠蚌（Cristaria plicata）等軟體動物中分離出GSTs序列［4］。環(huán)境污染物對貝類產(chǎn)生脅迫時，其機體內(nèi)GSTs表達水平顯著升高，并通過催化過氧化氫的氧化還原反應，清除體內(nèi)由代謝反應產(chǎn)生的氧自由基和過氧化物，保護細胞免受外界脅迫環(huán)境損傷［5-6］。在氧化應激條件下，GSTs表達水平被視為是一種適應性反應，GSTs表達被認為是受氧化應激的動物的分子標志物。

五氯酚（Pentachlorophenol，PCP）廣泛應用于農(nóng)藥、木材防腐劑和個人護膚品等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，目前在地表水、地下水、污水和飲用水中都不同程度檢測到［7-8］。PCP存在能夠給水生生物和人類生存帶來顯著的健康威脅，已被美國、歐洲和中國定為一種具有嚴重危害的持久性污染物［9-13］。背角無齒蚌（Anodonta woodiana）作為淡水底棲生物的重要類群，在淡水環(huán)境監(jiān)測中具有重要作用［14-15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PCP處理對背角無齒蚌具有顯著的毒性效應，具體機制有待進一步探討［16］。由此，本研究中從背角無齒蚌中克隆出σ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶完整基因序列并命名為σ-GST，通過Real-time PCR分析σ-GST時空表達，為揭示PCP脅迫效應奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場，PCP和二甲 亞 砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO） 購 自 Sigma-Aldrich公司，TRIzol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、RACE試劑盒均購自TaKaRa公司。其余常規(guī)藥品均為進口或國產(chǎn)分析純級。

背角無齒蚌（殼長 6.5±0.5 cm）處理之前，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中適應養(yǎng)殖2周。PCP溶解于DMSO中以制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒（40 cm×25 cm；10 cm 高）進行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水（每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和 0.5 mg KCl）［16］。為了確定 σ-GST 組織分布，來自同一塑料盒5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。根據(jù)上述動物處理方法，將80只河蚌隨機飼養(yǎng)于10個塑料盒中，8只/盒，分為對照組和PCP處理組，每組5個盒子。PCP處理組采用13.9 mg/L的PCP進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12 和 第15天從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 總RNA提取采用TRIzol試劑（寶生物生物有限公司，大連），1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應模板。

1.2.2 背角無齒蚌σ-GST核心片段的擴增 簡并引物σ-GST1和σ-GST2分離σ-GST cDNA保守區(qū)域片段，PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測序。確定σ-GST部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設計的特異性引物（表1），按照試劑盒要求，擴增σ-GST cDNA5'和3'區(qū)域序列，5'RACE和3'RACE的PCR產(chǎn)物進行測序和拼接。

1.2.3 σ-GST mRNA水平定量檢測 為了確定σ-GST轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)σ-GST-F和σ-GST-R引物常用PCR儀中分離靶基因（表1），瓊脂糖凝膠電泳僅在檢測出一個條帶，PCR產(chǎn)物測序，序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）進行real-time PCR，構(gòu)建標準曲線，通過2-ΔΔCT分析σ-GST表達水平。

表1 這項研究中使用的引物的描述

1.2.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 分析σ-GST序列，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫搜索（www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行BLAST程序比對；根據(jù)http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 預測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool（http：//smart.emblheidelberg.de/）預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)Ζ?GST基因進行多序列比對；通過Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）預測σ-GST的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 σ-GST表達水平以±s表示表示，采用雙向方差分析和兩兩比較分析（Leastsignificant difference，LSD），確定組間、時間、組間和時間交互作用來分析σ-GST表達顯著性差異。PCP處理后σ-GST的表達水平的顯著性差異采用單向方差分析（Analysis of variance，ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 背角無齒蚌σ-GST分子結(jié)構(gòu)

背角無齒蚌σ-GST的cDNA全長為821 bp，由一個132 bp 的5'非編碼區(qū)，一個80 bp的3'非編碼區(qū)和一個609 bp的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。開放閱讀框由203個氨基酸組成的多肽鏈，分子質(zhì)量為23.28 kD，等電點為5.19。終止信號（AATAAA）位于3'非編碼區(qū)794-799位置（圖1）。σ-GST氨基酸序列有N端的G-位點（3-73）和C端的H-位點（81-187）兩個保守區(qū)域（圖1）。

圖1 背角無齒蚌σ-GST基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列

背角無齒蚌σ-GST和其他水生動物GST進行多重序列比對，所有比對物種GST的N端區(qū)域高度保守，而C端區(qū)域則相對多樣化（圖2）。在σ-GST的N端G-位點為催化中心，由Tyr8、Arg14、Gln50、Pro52、Gln63和Ser64保守氨基酸殘基組成；C端H-位點為底物結(jié)合部位，由Glu96、Arg99、Arg100、Leu103、Lys104、Leu160和Thr163保守氨基酸殘基組成（圖2）。

圖2 背角無齒蚌σ-GST與其他物種σ型GST序列多重比對

2.2 背角無齒蚌σ-GST的二級和三級結(jié)構(gòu)分析

背角無齒蚌σ-GST蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由11個α-螺旋和4個β-折疊組成（圖3）。在N端結(jié)合GSH的G-位點包含3個α -螺旋和4個β-折疊，C端區(qū)域H-位點包含8個 α-螺旋。背角無齒蚌σ-GST三維結(jié)構(gòu)與其他物種σ -GST高度相似。

2.3 背角無齒蚌σ-GST系統(tǒng)進化

BLAST分析表明，背角無齒蚌σ-GST與σ-GST家族其他成員較高同源性。背角無齒蚌σ-GST氨基酸序列與雙殼類三角帆蚌（H. cumingii）σ型GST有92%同源性，與腹足綱海兔（Aplysia californica）有47%同源性，與非洲爪蟾（Xenopus laevis）有32%同源性，與昆蟲家蠶（Bombyx mori）有31%同源性（表 2）。

圖3 背角無齒蚌σ-GST二級和3D結(jié)構(gòu)預測

表2 背角無齒蚌σ-GST與其他物種GST序列同源性比較

為研究背角無齒蚌σ-GST與不同類型GST成員之間進化關系，分別從脊椎動物和無脊椎動物中選取不同類型GST成員，利用MEGA 5.0鄰位連接方法，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。不同群體中，背角無齒蚌σ-GST與無脊椎動物和脊椎動物σ型GST成員形成了σ家族譜系；背角無齒蚌σ-GST與軟體動物σ型GST成員親緣關系最近，其次脊椎動物，最后是昆蟲；在軟體動物的中，背角無齒蚌σ-GST進化關系與淡水蚌類親緣關系最近（圖4）。

2.4 背角無齒蚌σ-GST組織分布

背角無齒蚌σ-GST廣泛分布于斧足、外套膜、閉殼肌、心臟、肝胰腺、血淋巴和鰓（圖5）；在肝胰臟、鰓和血淋巴呈現(xiàn)相對高表達，外套膜和心臟中等表達水平，斧足和閉殼肌表達水平較低。

2.5 PCP對背角無齒蚌σ-GST表達的影響

在肝胰腺、鰓和血淋巴中，PCP處理后背角無齒蚌σ-GST在組別、時間、時間和組別交互作用中呈現(xiàn)表達水平顯著性差異（表3）。

圖4 根據(jù)背角無齒蚌σ-GST氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

圖5 背角無齒蚌σ-GST基因的空間表達

表3 背角無齒蚌σ-GST表達雙因素多種比較結(jié)果

在肝胰腺中，PCP處理后，背角無齒蚌σ-GST增加mRNA水平上調(diào)呈時間依賴模式；與對照組相比，σ-GST表達水平在第1、3和15天分別增加了28.73%、70.37%（P＜0.05）和 6.64 倍（P＜0.01）（圖 6）。與對照組相比，PCP處理組后鰓中σ-GST表達水平在第1天增加1.14倍（P＜0.05），第9天達到峰值（圖7）。與對照組相比，血淋巴中σ-GST表達水平明顯提高，在第3、9、12和15達到顯著水平（圖8）。

圖6 PCP對背角無齒蚌肝胰腺σ-GST基因表達的影響

圖7 PCP對背角無齒蚌鰓σ-GST基因表達的影響

圖8 PCP對背角無齒蚌血淋巴σ-GST基因表達的影響

3 討論

背角無齒蚌σ-GST開放閱讀框由203個氨基酸組成的多肽鏈，分子質(zhì)量為23.28 kD，等電點為5.19，不含有信號肽；已有研究顯示，三角帆蚌和褶紋冠蚌σ-GST沒有發(fā)現(xiàn)信號肽切割位點以及糖基化位點，故認為背角無齒蚌σ-GST可能是細胞溶質(zhì)蛋白［17-18］。背角無齒蚌σ-GST劃分為N 端區(qū)域和C端區(qū)域，這兩個區(qū)域與σ 類GST結(jié)構(gòu)非常相似。多重序列比對表明，背角無齒蚌σ-GST的N 端G-位點相對保守，C端多變，提示這些結(jié)構(gòu)特征與GST生物學功能有關。前期研究表明，GST的N端保守氨基酸殘基有助于結(jié)合GSH；一般來說，GSH結(jié)合G位點氨基酸組成具有高度特異性，常有11個高度保守氨基酸組成，分別為Tyr7、Arg13、Trp38、Lys46、Gln53、Leu54、Pro55、Gln66、Ser67、Glu98 和 Asp99，Tyr7在穩(wěn)定與GSH結(jié)合方面發(fā)揮重要作用［17-18］。C端的H-位點組成相對活躍與適應廣泛底物結(jié)合有關。H-位點是親電底物的結(jié)合點，有8個保守的氨基酸殘基：Tyr7、Phe8、Val10、Arg13、Val104、Tyr108、Asn204和 Gly205［19］。GST 中特定殘基緊鄰重要催化基團，表明GST家族具有底物催化多樣性的機制［19-20］。GST活性位點需要特定氨基酸殘基結(jié)合并在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中準確定位，從而產(chǎn)生更大功能和結(jié)構(gòu)上約束。在σ類GST，Tyr殘基影響GSH穩(wěn)定性，GSH與G位點的穩(wěn)定結(jié)合主要依賴于Tyr殘基；這種穩(wěn)定殘基是σ家族中ball-and-socket 類型細胞溶質(zhì)GSTs 的主要特征，這種穩(wěn)定殘基在胞漿GST結(jié)構(gòu)形成中起重要作用［19-20］。背角無齒蚌σ-GST氨基酸序列與三角帆蚌σ型GST有92%同源性，與菲律賓哈仔（R. philippinarum）σ型GST有58%同源性，與長牡蠣σ型GST有48%同源性，本研究獲取背角無齒蚌GST基因應屬于GST基因家族中的σ家族。一般來說GSTs的相似性在40% 以上可以認為是屬于同一個家族的，如果相似性低于30% 則可認為分屬于不同的家族［21］。系統(tǒng)進化結(jié)果顯示，背角無齒蚌σ-GST最接近于σ類GSTs，并將其歸于這一類群；其次是α類GSTs，與其他類型GSTs親緣關系較遠，提示σ類型GSTs從不同類型GSTs早期分化中具有一個獨立演化的過程。

背角無齒蚌σ-GST在多個組織廣泛分布，其中在肝胰腺、鰓和血淋巴中為高表達，外套膜和心臟中等表達水平，斧足和閉殼肌表達水平較低，提示σ-GST這種表達模式與機體抗氧化作用和組織功能有關。一般來說，活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）在機體中保持相對較低水平，ROS產(chǎn)生后會被一系列抗氧化劑酶迅速清除，實現(xiàn)ROS水平和抗氧化酶活性之間的平衡?？寡趸笍V泛分布是維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個重要標志。GSTs在水生無脊椎動物中分布根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)、酶的特性以及生理功能而有所不同，在疣荔枝螺（Thais clavigera）中，μ-GSTs主要在鰓中表達，其次是腎臟和肌肉［22］；菲律賓蛤仔ζ-GSTs 在血細胞中的表達量最高，其次是鰓和外套膜［23］。水生生物中研究表明，σ類GSTs在肝胰腺、鰓、血淋巴和性腺中大量表達，這種組織分布模式與動物解毒功能和先天免疫應答有關［24］。本研究中背角無齒蚌σ-GST組織間廣泛分布有助于清除機體活性氧，在細胞氧化和抗氧化之間維持平衡。雙殼類動物肝胰腺是重要代謝器官，在外源性有毒物質(zhì)降解和防止氧化應激方面起著重要作用，軟體動物GST能降解多種植物化學物質(zhì)和合成農(nóng)藥［25］。背角無齒蚌σ-GST在肝胰腺中的表達量高于其他組織，也表明了肝胰腺可能是外源物質(zhì)的主要解毒器官。

PCP處理能夠明顯誘導背角無齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中σ-GST表達，提示σ-GST表達上調(diào)對PCP毒性效應具有保護作用。對于有氧生物而言，ROS包括過氧化物陰離子、過氧化氫、烷基過氧化物、單線態(tài)氧和羥基自由基［26］。背角無齒蚌是濾食性淡水雙殼類動物，PCP具有較高親脂性，易沉積和過量積累在細胞內(nèi)，催化細胞產(chǎn)生ROS［9-10］。GST廣泛分布在所有活細胞中，主動或被動地結(jié)合各種外源性/內(nèi)源性有毒分子，如致癌物、藥物治療制劑和氧化應激產(chǎn)物，促進細胞解毒功能［27-28］。GST高表達與細胞免受內(nèi)源性氧化應激影響有關。高水平GST對抗農(nóng)藥的毒性有關，褐飛虱GST水平增高具有抗氧化損傷和保護組織作用［29］。銅和鎘脅迫均能促使厚殼貽貝（Mytilus coruscus）GST基因表達水平顯著升高，且呈現(xiàn)為時間依賴效應，提示GST參與動物的解毒過程，可以指示水環(huán)境重金屬污染狀況［30］。太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）在碳氫化合物和農(nóng)藥污染環(huán)境中，動物體內(nèi)各種亞型GST表達量都顯著增加，且與毒素類型以及濃度有關［31］。由此可見，σ-GST表達水平上調(diào)對PCP毒性效應具有保護作用。肝胰腺和血淋巴中，PCP處理后背角無齒蚌σ-GST表達水平上調(diào)顯示時間依賴效應，提示這種表達模式與ROS持續(xù)生成和機體應對氧化應激效應過程有關。在正常情況下，總ROS水平保持相對較低的水平，ROS被一系列抗氧化酶不斷消除，維持ROS水平和抗氧化酶活性之間的平衡。隨著PCP處理時間延長，ROS越來越多地在細胞中產(chǎn)生和積累。面對挑戰(zhàn)，機體以不斷增強抗氧化酶活性為對策消除活性氧，由此，背角無齒蚌σ-GST表達水平隨時間不斷上調(diào)。

有機污染物、工業(yè)廢水和環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等進入細胞后，大量O22-和H2O2等活性氧分子立即在細胞中產(chǎn)生，活性氧分子不但直接對細胞造成損傷，還將大量脂質(zhì)分子氧化成為過氧化脂質(zhì)，細胞膜結(jié)構(gòu)與功能會受到過氧化脂質(zhì)影響，機體正常生命活動受到危害。GST 分子具有細胞解毒和抗氧化雙重功效，PCP對背角無齒蚌產(chǎn)生脅迫時，其機體內(nèi)σ-GST表達水平顯著升高，并通過催化過氧化氫氧化還原反應，清除體內(nèi)由代謝反應產(chǎn)生的氧自由基和過氧化物，保護細胞免受外界脅迫環(huán)境損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，PCP處理后背角無齒蚌σ-GST在主要免疫器官肝胰腺、鰓和血淋巴表現(xiàn)出顯著的上調(diào)趨勢，推測背角無齒蚌σ-GST表達水平上調(diào)有助于對抗PCP處理所產(chǎn)生的脅迫效應，提高動物環(huán)境耐受能力。