絡(luò)石內(nèi)生菌露濕漆斑菌發(fā)酵液的細(xì)胞毒活性成分研究

陳 曦, 張小君, 葉 桐, 張雨欣, 申 麗

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

由于動(dòng)植物資源的限制，從微生物(尤其是特殊生境微生物)資源中尋找藥物先導(dǎo)化合物已成為天然藥物研究的主流方向[1]。植物內(nèi)生菌種類繁多而缺乏研究，在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中，能產(chǎn)生具有顯著生物活性和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的化合物。傳統(tǒng)藥用植物內(nèi)生菌和特殊生境植物內(nèi)生菌是植物內(nèi)生菌來源天然藥物的兩個(gè)重要研究領(lǐng)域。絡(luò)石Trachelospermumjasminoides(Lindl. ) Lem. 是夾竹桃科絡(luò)石屬常綠木質(zhì)藤本植物，其根、莖、葉、果實(shí)皆可供藥用。作為一種常用中藥，絡(luò)石具有祛風(fēng)活絡(luò)、利關(guān)節(jié)、止血、止痛消腫、清熱解毒之效能，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。前期實(shí)驗(yàn)從絡(luò)石中分離得到一株內(nèi)生真菌—露濕漆斑菌Myrotheciumroridum, 研究[2-5]表明，單端孢霉烯類化合物是M.roridum的特征次生代謝產(chǎn)物。單端孢霉烯類化合物具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性，尤其是顯著的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性[6-7]。本研究對(duì)該絡(luò)石內(nèi)生菌發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行分析，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎、抗腫瘤活性顯著的單端孢霉烯類化合物，為抗腫瘤新藥的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

以氫譜(1H-NMR譜)和薄層色譜(TLC)示蹤，采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行發(fā)酵液化學(xué)成分的分離純化，結(jié)果分離獲得2個(gè)單端孢霉烯類化合物12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2)。見圖1。體外細(xì)胞毒活性測(cè)定顯示，這兩個(gè)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞和Hela細(xì)胞均有顯著的增殖抑制活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 12′-hydroxyroridin E (1)能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯，并上調(diào)細(xì)胞中p27蛋白的表達(dá)，提示該化合物可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，該作用與細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

12'-hydroxyroridin E (1)

trichoverritone (2)

圖1 單端孢霉烯化合物的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

AVANCE DRX-500核磁共振儀, 德國(guó)Bruker公司; AVANCE 600核磁共振儀，德國(guó)Bruker公司; UHR-TOF maXis超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker公司; 高效液相色譜儀(L-7400檢測(cè)器, L-7100泵)，日本日立公司; P200Ⅱ高效液相色譜儀(UV200 Ⅱ檢測(cè)器, P200 Ⅱ型高壓恒流泵)，大連依利特公司; Series ⅡCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱, Thermo公司; centrifuge 5415D離心機(jī), Eppendorf公司; ELX800多功能酶標(biāo)儀, Bio-Tek公司; FACSCalibur流式細(xì)胞儀, BD公司; JY-ZY5Western blot電泳儀, Bio-Rad公司。

1.2 藥品與試劑

柱層析硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠分廠; Silica gel 60 F254鋁板(20 cm×20 cm), 瑞典Pharmacia Biotech公司; Sephadex LH-20, 瑞典Pharmacia Biotech公司; Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 美國(guó)GRACE公司, Hypersil ODS2(200 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，大連依利特分析儀器有限公司; 氘代氯仿，美國(guó)Aldrich公司; 氘代甲醇，青島騰龍微波科技有限公司; 氘代丙酮，美國(guó)Cambrideg Isotope Laboratories公司; 色譜甲醇，美國(guó)TEDIA化學(xué)試劑有限公司; RPMI 1640, 美國(guó)Gibco公司; 小牛血清，上海洛神公司; 胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司; MTT, 美國(guó)Amresco公司; 順鉑，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司; 碘化丙啶(PI), 上海江萊生物有限公司; 兔抗人p27抗體，美國(guó)Cell Signaling公司; 羊抗人β-actin單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司; 山羊抗兔IgG抗體，北京博士德公司; ECL化學(xué)發(fā)光試劑，北京普利萊公司; 其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2和人宮頸癌細(xì)胞株Hela由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化合物的分離純化

絡(luò)石內(nèi)生菌M.roridum采用液體發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次，減壓去除溶劑，再經(jīng)除鹽、除鈉得到粗浸膏12.2 g。采用硅膠柱層析進(jìn)行粗浸膏粗分離，氯仿/甲醇梯度洗脫(100∶0→0∶100), 經(jīng)TLC合并得到6個(gè)組分Fr. 1～Fr. 6。其中, Fr. 3經(jīng)硅膠柱層析、CHCl3-MeOH梯度洗脫(100∶0→100∶16)得到Fr. 3.2, Fr. 3.2再經(jīng)HPLC(甲醇-水 v/v 57∶43, 0.85 mL/min)純化得到化合物1(14.7 mg,tR=29.8 min)。Fr. 4經(jīng)硅膠柱層析得到Fr. 4-2和Fr. 4-3, Fr. 4-3先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，再經(jīng)HPLC(甲醇-水 v/v 50∶50, 1 mL/min)純化得到化合物2(2.1 mg,tR=7.0 min)。

2.2 化合物的體外細(xì)胞毒活性測(cè)定

腫瘤細(xì)胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，常規(guī)貼壁培養(yǎng)12 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入2 μL待測(cè)化合物[少量二甲基亞砜(DMSO)助溶, DMSO終濃度0.2%], 陰性對(duì)照組和空白組分別加入等體積DMSO和培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT, 繼續(xù)培育4 h。然后棄去培養(yǎng)液，每孔滴加150 μL DMSO, 37 ℃振蕩10 min, 使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞接種在6孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。然后每孔分別加入等量的化合物，干預(yù)24 h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞, 4 ℃保存過夜，至少固定18 h。上機(jī)測(cè)試前, 2 400轉(zhuǎn)/min離心10 min除去乙醇，將細(xì)胞重懸于0.4 mL碘化丙錠染液中(其中含RNaseA), 37 ℃保溫30 min(碘化丙錠染液終濃度為50 μg/mL, RNaseA終濃度為20 μg/mL), 然后用400目網(wǎng)篩過濾。最后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，應(yīng)用ModFit LT3.0軟件分析細(xì)胞周期中各期細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率。

2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取加藥處理后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入相應(yīng)體積的1×SDS蛋白裂解液，冰上放置30 min。以刮棒刮下細(xì)胞，沸水浴10 min, 然后4 ℃, 12 000 轉(zhuǎn)/min離心30 min。取上清，用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其相等，保證每個(gè)樣品孔蛋白的上樣量一致。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉4 h后，加入一抗過夜。經(jīng)洗滌后，再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)3～4 h。每步反應(yīng)結(jié)束均用PBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光，經(jīng)曝光、顯影、定影后，膠片晾干保存，掃描后用Image J軟件進(jìn)行圖像定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，組間差異用SNK法比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1: 無色油狀;1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.59 (1H, dd,J=15.4, 11.4 Hz, H-8′), 6.58 (1H, t,J=11.3 Hz, H-9′), 6.05 (1H, dd,J=7.8, 3.3 Hz, H-4), 5.89 (1H, br s, H-2′), 5.82 (1H, dd,J=15.5, 7.3 Hz, H-7′), 5.75 (1H, d,J=11.3 Hz, H-10′), 5.45 (1H, d,J=4.8 Hz, H-10), 4.80 (2H, d,J=9.1 Hz, H-12′), 3.86 (1H, m, H-11), 3.83 (1H, d,J=12.0 Hz, H-15a), 3.81 (1H, d,J=4.5 Hz, H-2), 3.73 (1H, m, H-5′b), 3.68 (1H, m, H-13′), 3.66 (1H, m, H-6′), 3.62 (1H, d,J=12.0 Hz, H-15b), 3.58 (1H, m, H-5′a), 3.10 (1H, d,J=3.9 Hz, H-13a), 2.78 (1H, d,J=3.9 Hz, H-13b), 2.69 (2H, m, H-4′), 2.48 (1H, br dd,J=15.5, 8.1Hz, H-3a), 2.04 (2H, m H-3b), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.95 (2H, m, H-8), 1.69 (3H, s, H-16), 1.58 (1H, m, H-7a), 1.10 (3H, d,J=5.8 Hz, H-14′), 0.81 (3H, s, H-14);13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 174.8 (C-3′), 168.3 (C-1′), 167.3 (C-11′), 144.2 (C-9′), 141.4 (C-9), 139.7 (C-7′), 131.3 (C-8′), 119.6 (C-10′), 119.4 (C-10), 117.4 (C-2′), 86.1 (C-6′), 79.7 (C-2), 76.1 (C-4), 74.2 (C-12′), 70.5 (C-13′), 67.6 (C-11), 67.1 (C-5′), 66.4 (C-12), 63.3 (C-15), 49.6 (C-5), 48.8 (C-13), 45.0 (C-6), 36.9 (C-3), 30.0 (C-4′), 28.8 (C-8), 24.0 (C-16), 21.9 (C-7), 19.2 (C-14′), 7.36 (C-14);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) δ: 172.0 (C-3′), 167.5 (C-11′), 144.8 (C-9′), 141.9 (C-7′), 141.4 (C-9), 131.5 (C-8′), 119.8 (C-10), 119.4 (C-10′), 116.7 (C-2′), 86.3 (C-6′), 80.4 (C-2), 77.1 (C-4), 75.6 (C-12′), 70.5 (C-13′), 68.6 (C-11), 67.8 (C-5′), 66.9 (C-12), 62.4 (C-15), 50.2 (C-5), 48.8 (C-13), 45.7 (C-6), 37.8 (C-3), 30.2 (C-4′), 29.1 (C-8), 23.4 (C-16), 21.9 (C-7), 19.1 (C-14′). 7.7 (C-14); HR-ESI-MSm/z553.2403[M+Na]+, 分子式C29H38O9(C29H38O9Na理論值為553.2408)。以上數(shù)據(jù)與研究[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為12′-hydroxyroridin E。

化合物2: 白色固體;1H-NMR (aceton-d6, 500 MHz) δ: 7.62 (1H, dd,J=15.5, 9.5 Hz, H-8′), 6.76 (1H, t,J=11.5 Hz, H-9′), 6.05 (1H, dd,J=15.5, 7.4 Hz, H-7′), 5.93 (1H, br s, H-2′), 5.84 (1H, dd,J=7.8, 3.5 Hz, H-4), 5.75 (1H, s, H-2″), 5.67 (1H, d,J=11.4 Hz, H-10′), 5.40 (1H, d,J=4.4 Hz, H-10), 4.88 (2H, br s, H-12′), 4.27 (1H, d,J=12.4 Hz, H-15), 4.03 (1H, d,J=12.4 Hz, H-15), 3.79 (1H, m, H-11), 3.79 (1H, m, H-5′), 3.77 (1H, m, H-6′), 3.76 (1H, m, H, -2), 3.73 (1H, m, H-13′), 3.70 (2H, m, H-5″), 3.66 (1H, m, H-5′), 3.09 (1H, d,J=4.1 Hz, H-13), 2.89 (1H, d,J=4.1 Hz, H-13), 2.78 (2H, m, H-4′), 2.55 (1H, dd,J=15.2, 7.8 Hz, H-3), 2.36 (2H, t,J=6.3 Hz, H-4″), 2.16 (3H, d,J=1.0 Hz, H-6″), 1.96 (1H, m, H-3), 1.96 (1H, m, H-8), 1.96 (1H, m, H-8), 1.93 (1H, m, H-7), 1.85 (1H, m, H-7), 1.68 (3H, s, H-16), 1.06 (3H, d,J=6.0 Hz, H-14′), 0.82 (3H, s, H-14);13C-NMR (aceton-d6, 125 MHz) δ: 174.5 (C-1′), 170.0 (C-3′), 166.5 (C-1″), 166.3 (C-11′), 158.9 (C-3″), 144.6 (C-9′), 141.5 (C-7′), 140.3 (C-9), 130.8 (C-8′), 119.9 (C-10), 118.8 (C-10′), 117.3 (C-2″), 116.5 (C-2′), 86.0 (C-6′), 79.5 (C-2), 76.1 (C-4), 74.2 (C-12′), 69.7 (C-13′), 67.5 (C-5′), 67.2 (C-11), 66.1 (C-12), 63.3 (C-15), 60.4 (C-5″), 49.7 (C-5), 48.1 (C-13), 44.6 (C-4″), 44.2 (C-6), 37.4 (C-3), 29.6 (C-4′), 28.6 (C-8), 23.2 (C-16), 21.7 (C-7), 19.1 (C-14′), 18.9 (C-6″), 7.5 (C-14); HR-ESI-MSm/z665.2895[M+Na]+, 分子式C35H46O11(C35H46NaO11理論值為665.2932)。以上數(shù)據(jù)與研究[5]報(bào)道基本一致, 故鑒定化合物為trichoverritone。

3.2 化合物的體外細(xì)胞毒活性

采用MTT法對(duì)化合物進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測(cè)定，測(cè)試細(xì)胞株為人肝癌細(xì)胞株HepG2和人宮頸癌細(xì)胞株Hela, 順鉑為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2)對(duì)HepG2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，其IC50值分別為0.78和1.86 μg/mL、0.05和0.13 μg/mL, 陽(yáng)性對(duì)照順鉑的IC50值分別為4.9和2.28 μg/mL。

3.3 化合物1對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期影響

細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期的精密調(diào)控，因此，細(xì)胞周期的失調(diào)是腫瘤發(fā)生的內(nèi)在因素。為探討12′-hydroxyroridin E (1)的增殖抑制作用是否與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，本研究采用一定濃度(0.01、0.1、1、2和10 μg/mL)的化合物1處理HepG2細(xì)胞24 h, 然后收集細(xì)胞，經(jīng)乙醇固定、PI染色后，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 12′-hydroxyroridin E處理后的HepG2細(xì)胞，其G2期細(xì)胞比例增加, G1期細(xì)胞比例略有上升, S期細(xì)胞比例明顯下降。見圖2。該結(jié)果提示, 12′-hydroxyroridin E可能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G2期周期阻滯，進(jìn)而抑制其細(xì)胞增殖。

圖2 化合物1對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期影響

3.4 化合物1對(duì)HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞周期

負(fù)調(diào)控蛋白p27表達(dá)的影響

p27是一種重要的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白[9], 為探討12′-hydroxyroridin E誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯的作用是否與p27蛋白相關(guān)，本研究采用一定濃度(0.01、0.1、1、2和10 μg/mL)的12′-hydroxyroridin E處理HepG2細(xì)胞24 h, 收集細(xì)胞蛋白，采用Western blot分析p27蛋白的表達(dá)，以未加藥孔蛋白作陰性對(duì)照(NC), actin為內(nèi)參。Western blot分析發(fā)現(xiàn), 12′-hydroxyroridin E處理后的HepG2細(xì)胞中p27蛋白表達(dá)量上升(見圖3), 提示該化合物可能通過上調(diào)p27蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞G2期阻滯。

與陰性對(duì)照NC相比, *P<0.05, **P<0.01圖3 化合物1對(duì)HepG2細(xì)胞p27蛋白表達(dá)的影響

4 討 論

由于人口增長(zhǎng)和社會(huì)老齡化，癌癥的發(fā)病率和致死率仍呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。據(jù)資料[10]統(tǒng)計(jì), 2018年全球癌癥新增病例1 810萬，死亡病例960萬; 75歲前患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)約為20%, 病死率為10%。目前癌癥治療主要采用手術(shù)、放療和化療等綜合措施，其中化學(xué)藥物治療存在藥物價(jià)格貴、治療效果差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高且腫瘤治療副作用大、精準(zhǔn)性差等問題，因此，臨床迫切需要高效、低毒的新型藥物。天然產(chǎn)物在新藥及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用。Butler等[11]調(diào)查發(fā)現(xiàn), 2008—2013年共有25個(gè)天然產(chǎn)物和天然產(chǎn)物衍生藥物被批準(zhǔn)上市; 2008—2013年處于臨床試驗(yàn)的100個(gè)天然產(chǎn)物相關(guān)藥物中, 50個(gè)藥物是直接天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的半合成衍生物，其中38個(gè)藥物是抗腫瘤藥物。盡管合成化學(xué)與現(xiàn)代組合化學(xué)及高通量藥物篩選技術(shù)交叉結(jié)合加快了抗腫瘤新藥的研制，但目前從天然資源中尋找抗腫瘤活性物質(zhì)仍然是發(fā)現(xiàn)新藥的主要途徑。本研究對(duì)絡(luò)石內(nèi)生菌M.roridum發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果分離獲得2個(gè)具有顯著體外細(xì)胞毒活性的單端孢霉烯化合物12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2), 為后續(xù)研究提供了化合物來源。

細(xì)胞周期主要由細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI)共同調(diào)節(jié)。CDKI可分為兩類，即特異性抑制cyclin D-CDK4/CDK6活性的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑4(INK4)(包括p15、p16、p18和p19)和廣譜的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶相互作用蛋白(CIP)/激酶相互作用蛋白(KIP)(包括p21、p27和p57)[12]。作為非特異性CDKI, p27(也稱為KIP1)主要通過抑制G1期的細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物(如細(xì)胞周期蛋白E-CDK2和細(xì)胞周期蛋白D-CDK2)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控[13-14]。單端孢霉烯化合物mytoxin B和myrothecine A對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制與p27介導(dǎo)的S期細(xì)胞周期阻滯相關(guān)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn), 12′-hydroxyroridin E (1)對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用與G2期細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。這說明單端孢霉烯化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞株的增殖抑制作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯密切相關(guān)。

細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡之間存在密切聯(lián)系。除細(xì)胞周期阻滯外，細(xì)胞凋亡(Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡, PCD)也可引起細(xì)胞的增殖抑制[16-17]。靶向腫瘤相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生發(fā)展成為化學(xué)藥物治療的一種重要策略。PI3K/Akt信號(hào)通路是酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18], 其通過影響下游效應(yīng)分子的活性在細(xì)胞凋亡和增殖中起關(guān)鍵作用。研究[19-20]表明, PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。單端孢霉烯類化合物是否能夠靶向PI3K/Akt信號(hào)通路、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其體外抗腫瘤作用，值得進(jìn)一步深入研究。