Myc可控表達的B細胞淋巴瘤小鼠模型的建立

韓琳琳, 李 斐, 李 艷, 吳 凡, 郁多男

(江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室, 揚州大學, 江蘇 揚州, 225001)

淋巴瘤是淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的總稱，其死亡率較高，患者預后差，發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。世界衛(wèi)生組織將淋巴瘤分為霍奇金淋巴瘤(HL)與非霍奇金淋巴瘤(NHL)。國際淋巴瘤研究組織又將淋巴瘤分為B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤和自然殺傷(NK)細胞淋巴瘤。目前, HL發(fā)病率較低，僅占10.9%, 且以每年3.0%～4.0%速率下降，而NHL發(fā)病率較高，占89.1%, 其中在兒童及青壯年比例較高。B細胞淋巴瘤是B細胞發(fā)生的實體腫瘤，約占惡性淋巴瘤的70.0%～80.0%[3], 其主要起源于淋巴組織生發(fā)中心的B細胞[4]。約40.0%的B細胞淋巴瘤存在染色體易位，這將導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。

Myc是一種癌基因，位于染色體8q24上，它編碼蛋白C-Myc基因、L-Myc基因和N-Myc基因[6]。L-Myc作用較少, N-Myc可以在小鼠發(fā)育、細胞生長和分化中取代C-Myc功能，但N-Myc的表達具有組織限制性[7], 只有C-Myc基因在細胞的增殖、凋亡、蛋白質(zhì)合成、DNA復制及促進血管形成等生物學過程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。在伯基特淋巴瘤中, 90%以上出現(xiàn)Myc染色體的易位[11]。腫瘤的抑制是腫瘤抑制因子p53起著核心的作用[12], 而p53是一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以通過調(diào)控其目標基因的表達來發(fā)揮作用[13-14]。然而, p53可以被一些應(yīng)激信號激活，如有絲分裂的持續(xù)促進和DNA的損傷。同時，p53的激活可以導致細胞周期的停滯，進而導致細胞的凋亡[15]; p53也可以通過抑制與細胞周期無關(guān)的調(diào)節(jié)，如抑制腫瘤血管的生成[16]。大多腫瘤的形成與p53功能的失活有關(guān)，它的失活主要見于基因的突變與病毒癌蛋白的相互作用。

本研究利用Myc可控表達且p53失活的原理建立了B細胞淋巴瘤小鼠模型，利用敲入的可編碼Myc和雌激素受體(ER)融合蛋白MycERTAM的等位基因，實現(xiàn)對Myc的“失活”與“激活”的調(diào)控[17], 現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物

1.1.1 細胞培養(yǎng): GP+E86包裝細胞受贈于美國賓夕法尼亞大學AndreiThomas-Tikhonenko實驗室, DMEM高糖, 10%胎牛血清, 10%雙抗, 37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建: 以MIGR1為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，成功構(gòu)建MIGR1-MycER的逆轉(zhuǎn)錄病毒。細胞轉(zhuǎn)染: 40 μL Lipofectamine 2000, 2 μg vsvg, 2 μg gagpol, 10 μg MIGR1-MycER, 混勻后室溫靜置10 min, 加入GP+E86細胞中，混勻后放入細胞培養(yǎng)箱過夜, 12 h后換液, 48 h后用新霉素(G418)篩選，細胞繼續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.1.3 小鼠皮下注射: p53敲除鼠和野生型C57BL/6小鼠雜交8代后，將小鼠脫臼處死，取小鼠四肢骨髓，用2 mL注射器吸取PBS沖洗出骨髓組織，與轉(zhuǎn)染了MIGR1-MycER的GP+E86細胞混勻。選取6～8周C57BL/6同源小鼠10只分組行皮下注射，觀察小鼠體內(nèi)腫瘤生長情況。

1.2 藥物

他莫昔芬粉末(Sigma, T5648)超聲溶解于玉米油(Sigma, C8267)中, 10 mg/mL。每日腹腔注射1次，每只小鼠1 mg。

1.3 流式細胞術(shù)

將小鼠脫臼處死后，取出骨髓組織, PBS洗滌2次，由于MIGR1-MycER攜帶綠色熒光蛋白(GFP), 骨髓內(nèi)的腫瘤細胞攜有GFP熒光蛋白，可通過流式細胞術(shù)檢測到Myc表達細胞。

2 結(jié) 果

2.1 Myc可調(diào)控的B細胞淋巴瘤小鼠模型的建立

將p53-null骨髓細胞與轉(zhuǎn)染了MIGR1-MycER的GP+E86細胞混勻，經(jīng)皮下注射到C57BL/6小鼠。由于此時Myc不能進入細胞核而處于“失活”狀態(tài)，所以未見腫瘤形成。而在TAM腹腔注射后，Myc激活，進而促進了腫瘤的形成(圖1A)。將小鼠腫瘤取出后，用70 μm尼龍網(wǎng)研磨，紅細胞裂解液裂解紅細胞后，用CD19抗體標記，流式檢測結(jié)果證實該腫瘤來源于B細胞淋巴瘤(圖1B)。

A: 小鼠模型實驗設(shè)計; B: 腫瘤細胞流式檢測結(jié)果

圖1 Myc可調(diào)控B細胞淋巴瘤小鼠模型的建立

2.2 MycER淋巴瘤小鼠模型的皮下腫瘤生長速度具有他莫昔芬(TAM)依賴性

C57BL/6小鼠皮下注射2×106個MycER B淋巴瘤細胞后，小鼠隨機分為3組: TAM+/+組，小鼠連續(xù)注射TAM, 腫瘤在第8天開始迅速變大; TAM+/-組，小鼠連續(xù)注射TAM, 到第8天停止TAM注射，腫瘤開始變小; 對照組小鼠未注射TAM, 則無腫瘤生長。見圖2A。第14天將TAM+/+組與TAM+/-組小鼠脫臼處死，取出腫瘤分別稱量, TAM+/+組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著高于TAM+/-組(P<0.01)。見圖2B。上述結(jié)果表明, TAM注射后可使Myc入核，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

A: TAM+/+組、TAM+/-組及對照組小鼠腫瘤體積變化，其中TAM+/+組為連續(xù)注射TAM, TAM+/-組為連續(xù)

注射TAM至第8天，對照組未注射TAM; B: TAM+/+組、TAM+/-組小鼠腫瘤質(zhì)量比較。與TAM+/-組比較, **P<0.01。

圖2 Myc調(diào)控B細胞淋巴瘤生長的作用

2.3 MycER淋巴瘤小鼠模型的全身性腫瘤細胞生長速度具有TAM依賴性

C57BL/6小鼠隨機分為2組，每組5只，將2×106個MycER細胞注射到鼠尾靜脈。熒光顯微鏡下觀察TAM+/+與TAM+/-淋巴瘤細胞的生長情況。連續(xù)2周注射TAM后(TAM+/+), 取出小鼠骨髓，用70 μm尼龍網(wǎng)研磨，PBS洗滌2次，倒置顯微鏡下可見大量綠色熒光細胞(圖3A)，連續(xù)注射TAM到第8天停止TAM注射(TAM+/-)的小鼠骨髓幾乎未見GFP陽性細胞(圖3B), 流式細胞儀檢測結(jié)果進一步驗證此結(jié)果(圖3C)。上述結(jié)果表明，腹腔注射TAM可以使Myc入核，促使淋巴瘤細胞生長，而停止注射TAM后, Myc無法入核，淋巴瘤細胞幾乎停止生長。

A、B: 使用倒置熒光顯微鏡觀察TAM+/+或TAM+/-的小鼠骨髓細胞，普通相差與綠色熒光是相同的觀察視野;C: 流式細胞術(shù)分析TAM+/+或TAM+/-小鼠腫瘤細胞在骨髓中的比例

圖3 TAM對MycER腫瘤細胞在骨髓中增殖的影響

除了觀察骨髓中腫瘤細胞的生長是否依賴Myc作用之外，作者還通過組織學觀察了小鼠主要臟器中腫瘤細胞的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔持續(xù)注射TAM(TAM+/+)后小鼠主要臟器均有大量腫瘤細胞的生長，表現(xiàn)為肝、脾、淋巴結(jié)、肺、腎依次為()、()、()、(+)、(+), 其中()代表腫瘤細胞占據(jù)整個臟器的40%以上, ()代表腫瘤細胞占據(jù)整個臟器的30%以上, (+)代表腫瘤細胞占據(jù)整個臟器的10%以上。連續(xù)注射TAM到第8天后停止TAM注射(TAM+/-)小鼠主要臟器未觀察到明顯的腫瘤細胞存在。

2.4 MycER誘導的B細胞淋巴瘤可以不依賴于Myc而繼續(xù)生長

為了更好的研究腫瘤生長動力學，作者將2×106個腫瘤細胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并將其分為2組，每組3只小鼠, TAM+/+組小鼠進行TAM腹腔注射，腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM到第8天后停用，腫瘤體積逐漸變小，并停止生長，但3周后即使未注射TAM，腫瘤又重新生長。本實驗重復至少3次，上述結(jié)果說明此種情況下，腫瘤的復發(fā)可以不依賴于Myc的作用。見圖4。

TAM+/+組小鼠進行TAM腹腔注射,腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM到第8天后停用,腫瘤體積逐漸變小,但3周后即使未注射TAM, 腫瘤又重新生長。圖4 MycER腫瘤細胞的生長可以不依賴于Myc的作用

2.5 TAM+/-組小鼠重新注射TAM后瘤體急劇生長

將2×106個腫瘤細胞注射到C57BL/6小鼠皮下，并將其分為3組，每組2只小鼠。TAM+/+組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 腫瘤逐漸變小，但22 d左右開始緩慢生長; TAM+/-/+組小鼠于TAM第8天停止注射，腫瘤體積也逐漸變小，但于第22天恢復腹腔注射TAM, 腫瘤體積急劇變大。本實驗重復至少3次，上述結(jié)果說明MycER淋巴瘤細胞的生長盡管可以不依賴于Myc的作用，但Myc仍然可以使腫瘤的生長速度增加，而且與原發(fā)腫瘤的生長作用相比, Myc對復發(fā)瘤的作用更明顯。見圖5。

TAM+/+組小鼠連續(xù)腹腔注射TAM, 腫瘤體積迅速增大; TAM+/-組小鼠于第8天停止腹腔注射TAM, 腫瘤逐漸變小,但22 d左右開始緩慢生長; TAM+/-/+組小鼠于TAM第8天停止注射,腫瘤體積也逐漸變小,但于第22天恢復腹腔注射TAM, 腫瘤體積急劇變大。圖5 TAM的不同注射情況對MycER腫瘤生長情況的影響

3 討 論

Myc作為一種癌基因，它易位到免疫球蛋白增強子下游是伯基特淋巴瘤形成的標志性分子生物學特征[18]。Myc可以調(diào)控約15%的人類基因[19]。Myc的表達與多種調(diào)控機制密切相關(guān)，包括位于啟動子區(qū)域基序的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[20-21]。

本實驗室建立了MycER/p53-null的B細胞淋巴瘤的小鼠模型，用TAM實現(xiàn)Myc“開”與“關(guān)”的兩種狀態(tài)的調(diào)控。作者將MycER逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞與p53敲除小鼠骨髓細胞混合后注射到C57BL/6小鼠皮下，此時被MycER感染的骨髓細胞中的Myc不能入核，所以未見腫瘤出現(xiàn)。當腹腔持續(xù)注射TAM時, Myc入核，發(fā)揮促癌作用，腫瘤開始生長; 而當TAM撤離后腫瘤生長立即停止, 3～4周后腫瘤又開始重新生長。這些重新生長的腫瘤細胞(“逃逸者”)是不依賴于Myc的調(diào)控，但是再次給予TAM可導致腫瘤生長急劇加速，體積比原發(fā)腫瘤更大。這種再生長的腫瘤細胞雖然不依賴于Myc的生長，但是對Myc更加敏感。

目前，越來越多的科學家研究B細胞淋巴瘤的發(fā)病機制及治療方法，但仍未見有效、可靠的治療策略。雖然臨床上應(yīng)用抗CD20單克隆治療B細胞淋巴瘤有一定的效果，但不是所有的患者對利妥昔單抗治療敏感，因此迫切需要新的靶向治療方法[22]。本課題成功建立了B淋巴瘤小鼠模型，此模型不僅具有人類伯基特淋巴瘤的分子與病理特征，還可自主調(diào)控Myc的活性，為臨床研究B細胞淋巴瘤的相關(guān)機制及作用靶點提供了有效的模型。