一株產(chǎn)酸黑曲霉的分離鑒定及其在鹽堿土改良中的應(yīng)用

鄭曉梅 丁旭揚(yáng) 黃婷 陳孝平

摘要：本研究從青島海邊鹽土土樣中篩選得到試驗(yàn)菌株，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、產(chǎn)酸及耐鹽能力鑒定，同時將其配制成菌劑加入不同基質(zhì)中施入鹽堿土壤以探究其在鹽堿地改良中的應(yīng)用潛力。結(jié)果顯示：形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法鑒定得到該菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）;它能夠分泌有機(jī)酸，能在80 h內(nèi)將發(fā)酵液pH值由6.58降至1.96;并且在10% NaCl或10% （NH4）2SO4的液體培養(yǎng)基中保持較好的生長曲線，擁有較好耐鹽能力。以不同基質(zhì)作為生長介質(zhì)將菌劑直接施加到鹽堿土壤56 d后，檢測到添加不同基質(zhì)的鹽堿土壤pH值可降低0.86～1.60，含鹽量也下降。因此黑曲霉在鹽堿地改良中具有較好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：黑曲霉;鹽堿地;鑒定;改良

中圖分類號：S154.2：S156.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）04-0069-06

Abstract In this study， the experimental strain was screened out from the coastal saline soil samples in Qingdao， and was identified through the morphology， molecular biology， acid production and salt tolerance，so as to explore the application potential in the improvement of saline-alkali land. Through the morphological and molecular biological methods，the strain was identified?? as Aspergillus niger. This strain could secrete organic acid and reduce the pH value of the fermentation broth from 6.58 to 1.96 within 80 hours. At the same time， the strain maintained a good growth curve and had a good salt tolerance in the liquid medium with 10% NaCl or 10% （NH4）2SO4. The microbial inoculum was directly applied to the saline-alkali soil with different substrates as growth media， after 56 days， it was detected that the pH values of the saline-alkali soils added with different substrates reduced by 0.86 ～ 1.60， and the salt contents also decreased. Therefore， Aspergillus niger had a good application potential in the improvement of saline-alkali land.

Keywords Aspergillus niger; Saline-alkali soil; Identification; Improvement

鹽堿地是鹽類集積的一類土地，其土壤中所含的鹽分可對作物的正常生長產(chǎn)生影響，在鹽堿程度嚴(yán)重地區(qū)植物幾乎不能生存。中國是世界排名第三的鹽堿地大國[1]，未開發(fā)和影響耕種的鹽堿地總面積大于0.33×108 hm2，分布于東北、西北、華北及濱海等地區(qū)在內(nèi)的17個省區(qū)，改良鹽堿地已成為改善我國環(huán)境和解決我國糧食安全問題的重要手段。目前對鹽堿地的改良方法可分為物理、化學(xué)和生物改良法[2]。物理、化學(xué)方法存在成本高、工程大、改良后土壤等級差并且容易返鹽等問題;而生物方法研究較少，且大多為植物改良，也存在周期長等問題[3]。因此，尋求成本低廉、效果持久、周期較短的新改良方法一直是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。

微生物改良鹽堿地的方法具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，還可防止土壤惡化，所以在改良低肥力的鹽堿地上表現(xiàn)出重大的應(yīng)用潛力[4]。目前用于鹽堿地改良的生物功能菌有硫氧化細(xì)菌[5]、磷細(xì)菌[6]、鉀細(xì)菌[7]、菌根菌[8]和光合細(xì)菌[9]，它們可以使鹽堿土pH值下降0.25～1.00[5-11]。霉菌屬于真菌的一個類別，能分泌生物酸，如草酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸和葡萄糖酸等多種有機(jī)酸[12，13]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品等多個領(lǐng)域中。但目前鮮有用霉菌直接降鹽或降pH值來改良鹽堿土壤的研究報(bào)道。本研究從青島海邊鹽土中分離一株霉菌，并對其進(jìn)行純化和形態(tài)、分子生物學(xué)鑒定，對其產(chǎn)酸能力及耐鹽能力進(jìn)行分析，以期探究霉菌在鹽堿土壤改良中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品（用于菌株篩選）取自青島海邊鹽土（約N37°03′，E119°40′）。供試對照菌株為放線菌（WH17050900907），本實(shí)驗(yàn)室自鹽堿地篩選。

供試培養(yǎng)基：剛果紅培養(yǎng)基（NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO3 01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 001 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂15 g，剛果紅02 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)整pH值在70～74之間，121℃滅菌20 min）;察氏瓊脂培養(yǎng)基（NaNO3 2 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 05 g，KCl 05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 001 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)整pH 值在70～74范圍內(nèi)，121℃滅菌20 min）;發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖50 g，酵母粉5 g，KH2PO4·H2O 14 g，MgSO4·7H2O 05 g，（NH4）2SO4 10 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，ZnSO4 0.03 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)整pH值為 6.8，112℃滅菌30 min）。

供試有機(jī)質(zhì)材料為麥麩、豆渣、干草、樹葉、玉米粉、甘蔗渣、橘皮。鹽堿土（用于菌株耐鹽鑒定）取自河南省蘭考縣城關(guān)鄉(xiāng)余寨村鹽堿地（約N34°46′，E114°48′），初始pH值為9.80，含鹽量約為10 g/kg。自制復(fù)合肥（蔗糖∶NaNO3=3∶1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選、純化及形態(tài)學(xué)鑒定 稱取1 g土壤樣品溶于9 mL無菌水，稀釋103、104、105倍后分別涂于剛果紅培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，將產(chǎn)生較大藍(lán)紫色透明圈的菌落挑出，反復(fù)劃線分離獲得純種菌株，斜面保藏于試管中。取菌株接種于察氏培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)5 d，運(yùn)用直接制片觀察法制片鏡檢進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，采用CTAB法提取基因組DNA，擴(kuò)增目標(biāo)菌株的ITS rDNA序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。序列測定結(jié)果用BLAST，選擇GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，比對后從GenBank中選擇和下載近緣菌株的ITS rDNA序列，用Mega X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的產(chǎn)酸能力鑒定 準(zhǔn)備33個150 mL錐形瓶，每瓶裝入60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，112℃滅菌30 min，冷卻至室溫。接種環(huán)挑取一環(huán)菌株溶解于5 mL無菌水中，搖勻后取0.2 mL接種于滅菌的發(fā)酵液中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔8 h取出3瓶測菌液pH值。

1.2.4 菌株的耐鹽能力鑒定 將試驗(yàn)培養(yǎng)基按照表1進(jìn)行配制。7種培養(yǎng)基分別混合均勻后，均于121℃滅菌20 min。挑取黃豆粒大小的菌株于100 mL無菌水中，混合均勻。分別于各平板中接入5 mL菌液，混合均勻，30℃培養(yǎng)，每隔4 h觀察并記錄菌株生長情況，并將觀察時未生長的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接于剛果紅固體培養(yǎng)基檢測菌株存活情況。

1.2.7 菌株在有機(jī)質(zhì)中的生長探究 分別稱取一定量有機(jī)介質(zhì)：碎干草（校園，禾本科）、碎樹葉（校園，泡桐）、麥麩、豆渣、碎橘皮、甘蔗渣、玉米粉、麥麩豆渣混合物、碎干草樹葉混合物于培養(yǎng)皿中，滅菌備用。接種環(huán)挑取黃豆大小黑曲霉于500 mL無菌水中充分混勻。將菌液接種于滅菌有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5 d，每隔12 h觀察并記錄每種有機(jī)質(zhì)上菌種生長狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)特征：菌叢大而疏松，正面呈黑褐色，背面白色至黃色，頂囊和分生孢子均為球形，頂囊放射狀排滿小梗，分生孢子呈黑褐色，具有霉味（圖1）。根據(jù)形態(tài)初步判定其為一株黑曲霉[14]。

[HT6SS]A.培養(yǎng)基正面;B.培養(yǎng)基背面;C.顯微鏡下菌種形態(tài);D.顯微鏡下孢子囊形態(tài)

[JZ]圖1 菌株AN1014形態(tài)學(xué)鑒定

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，黑曲霉Aspergillus niger strain 01NT.1.5.4與試驗(yàn)菌株（AN1014）同源性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株AN1014為黑曲霉。

2.3 黑曲霉產(chǎn)酸能力

黑曲霉接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)80 h后，培養(yǎng)基對應(yīng)pH值由6.58降至1.96。0～8 h黑曲霉處于延滯期，菌株處于適應(yīng)與儲備階段，試驗(yàn)過程中未明顯觀察到菌株生長;8～24 h菌株代謝旺盛，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，發(fā)酵液pH值下降較快，在此階段觀察到菌株聚集成菌絲球，菌體繁殖迅速;32～64 h菌株生長代謝減緩，pH值下降隨之減緩;64 h之后，發(fā)酵液中的菌體近乎停止生長，72 h后菌絲球伴有降解現(xiàn)象（圖3）。試驗(yàn)證明，該菌株具有良好的產(chǎn)酸能力，在生長代謝過程中能產(chǎn)生大量有機(jī)酸。

2.4 黑曲霉耐鹽能力分析

[HT5K]2.4.1 黑曲霉耐鹽能力 [HT] A、D、F、E、B、G處理培養(yǎng)基在60 h內(nèi)分別先后生長出明顯的肉眼可見的菌絲體，但C處理（3.50 g麥麩豆渣有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)基添加1.05 g NaCl），由于過高的NaCl濃度，菌體始終未生長（表4）。將此處理試驗(yàn)平板上的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)接到剛果紅培養(yǎng)基上，剛果紅培養(yǎng)基上長出菌落，產(chǎn)生紫色透明圈，生長時間與普通轉(zhuǎn)接試驗(yàn)的無異，證明1.05 g NaCl濃度抑制菌體生長但未影響其生長潛力。

2.4.2 黑曲霉與放線菌對鹽耐受力比較 前60 h，10%NaCl組中黑曲霉的生長率一直都高于放線菌，10%（NH4）2SO4組中黑曲霉的生長率在培養(yǎng)66 h內(nèi)也一直都高于放線菌（圖4），30 h之后10%（NH4）2SO4發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的生長情況甚至優(yōu)于普通發(fā)酵培養(yǎng)基。綜合比較，在10%NaCl和10%（NH4）2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，黑曲霉較放線菌表現(xiàn)出更好的適應(yīng)能力。生長率計(jì)算公式：

生長率=10%NaCl或（NH4）2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌株干重/普通發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌株干重。

2.5 黑曲霉對鹽堿土的作用

由圖5可以看出，與CK相比，不施加菌劑的土壤均可明顯看出相應(yīng)檢測指標(biāo)數(shù)值的降低。效果較為明顯的為添加5.0 g NaNO3+5.0 g菌劑土壤的pH值，相對于CK下降1.60，相對于添加5.0 g NaNO3但不施加菌劑的處理下降1.24。添加5.0 g豆渣施+5.0 g菌劑的土壤pH值相對于CK下降1.37，相對于添加5.0 g豆渣但不施加菌劑的土壤下降1.22。復(fù)合肥的效果略差，但也有明顯下降。本試驗(yàn)中，在56 d內(nèi)，添加菌劑的土壤中含鹽量和pH值均有明顯下降，可見試驗(yàn)黑曲霉對降鹽和降pH值均有一定效果。

2.6 黑曲霉自然有機(jī)生長介質(zhì)探究

由表5可知，黑曲霉在麥麩、豆渣、碎干草等日常廢棄有機(jī)質(zhì)材料中可以較好生長，在部分混合材料中生長良好。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，試驗(yàn)黑曲霉擁有良好的耐鹽能力，能夠在高鹽環(huán)境中生長，這是將黑曲霉運(yùn)用于鹽堿地改良的必要前提。試驗(yàn)黑曲霉具有良好的產(chǎn)酸能力，在NaNO3存在條件下，能夠在較短時間內(nèi)使鹽堿土的pH值下降1.60，顯著優(yōu)于其它微生物，在已有的研究中鮮少見到此類可以在較短時間內(nèi)較大幅度降pH值的報(bào)道;同時，在運(yùn)用黑曲霉改良鹽堿土的試驗(yàn)中，土壤含鹽量也明顯下降。相較于已有的鹽堿地改良案例，將黑曲霉運(yùn)用于鹽堿地改良具有周期短、效力強(qiáng)的優(yōu)越性。另外，本研究顯示，黑曲霉可以在廉價(jià)易得甚至日常廢棄的有機(jī)質(zhì)材料中較好生長。此類材料不論是在經(jīng)濟(jì)上還是獲取途徑上，相較于一般肥料或者基質(zhì)都表現(xiàn)出極大的優(yōu)越性。另外，將其施入土壤中也可代替日常肥料為土壤提供養(yǎng)料。此結(jié)果使本研究探索的將黑曲霉用于鹽堿地改良表現(xiàn)出了實(shí)施可行性與經(jīng)濟(jì)可行性。

本研究將霉菌應(yīng)用于鹽堿地的改良并獲得顯著的效果，為微生物修復(fù)鹽堿土提供了較新的研究思路，在解決鹽堿地問題上具有良好的應(yīng)用潛力。目前仍有以下問題值得探索：（1）黑曲霉在鹽堿土中的生長規(guī)律和泌酸持續(xù)時間，從而探究適合黑曲霉的最佳生長條件，使黑曲霉能夠高效分泌有機(jī)酸，降低鹽堿土的pH值;（2）霉菌的降鹽機(jī)理以及最優(yōu)降鹽條件，進(jìn)而研究使霉菌高效降鹽的方法，以期在鹽堿地改良中達(dá)到優(yōu)良降鹽效果;（3）普遍認(rèn)為，在鹽堿地改良中混合菌劑優(yōu)于單菌種，因此尋求多種能與黑曲霉相互協(xié)同的特定微生物是必要的;（4）篩選對作物無害的菌株或者在鹽堿地改良完成后引入其它措施將菌株殺滅，避免菌株對作物生長產(chǎn)生負(fù)面影響。

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