忍冬果實抗氧化活性研究

郭慶梅 路欣榮 和煥香

摘要：為研究忍冬果實的抗氧化活性，本試驗對其乙醇冷浸提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，并通過DPPH法、鐵氰化鉀法和FRAP法評價不同極性部位的抗氧化活性。結(jié)果表明：抗壞血酸及忍冬果實各極性部位對DPPH自由基的清除能力為：乙酸乙酯部位>VC>正丁醇部位>石油醚部位;其還原能力為：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位;總抗氧化能力為：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。綜合分析得出忍冬果實提取物的不同極性部位均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的抗氧化活性最顯著，石油醚部位的抗氧化活性最弱。

關(guān)鍵詞：忍冬果實;不同極性部位;抗氧化活性

中圖分類號：S567.101文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）04-0061-04

Abstract In the study， the ethanol cold-dip extract of the fruits of Lonicera japonica was extracted with petroleum ether， ethyl acetate and n-butanol in sequence to obtain three different extracts. And the antioxidant activities of? all the extracts were evaluated by DPPH method， potassium ferricyanide method and FRAP method. The results showed that the abilities of VC and all the extracts to scavenge DPPH radicals were sequenced in the order of ethyl acetate fraction>VC>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. Their? reducing power were showed as VC>ethyl acetate fraction>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. And the total antioxidant capacity followed the sequence of VC>ethyl acetate fraction>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. The different polar fraction of fruits extracts of Lonicera japonicae had certain antioxidant activities， among them， the antioxidant activity of ethyl acetate fraction was the most significant， and that of petroleum ether fraction was the weakest.

Keywords Fruits of L. japonica; Different polar fraction; Antioxidant activity

忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）為半常綠藤本植物[1]，其干燥花蕾或待初開的花、莖枝分別為中藥金銀花和忍冬藤，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[2]。忍冬果實又稱“銀花子”或“金銀花子”，據(jù)《飲片新參》記載，其“味苦涼澀”，具有“清血化濕熱、治腸風(fēng)赤痢”的作用[3]。目前，國內(nèi)外關(guān)于忍冬果實的研究相對較少，僅對忍冬果實極性部位化學(xué)成分進(jìn)行過分析，僅在提取工藝、抑菌活性及揮發(fā)油體外抗氧化活性方面有初步研究，未見對忍冬果實醇提物不同極性部位的體外抗氧化研究[4-8]。

忍冬果實作為忍冬的副產(chǎn)物，由于對其藥用價值認(rèn)識的欠缺，而未能得到有效利用，尤其是在金銀花產(chǎn)量過剩導(dǎo)致大量結(jié)果時，更是造成資源浪費(fèi)。本研究利用溶劑萃取法將忍冬果實提取物分為三個極性部位，通過DPPH法、鐵氰化鉀法和FRAP法，檢測不同極性部位的清除自由基能力、對Fe3+還原能力及總抗氧化能力，評價忍冬果實不同極性部位體外抗氧化能力并確定有效部位，以期加深對忍冬果實藥用價值的認(rèn)識，為其進(jìn)一步地開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

忍冬果實于2017年7月采于山東省萊蕪市鋼城區(qū)（現(xiàn)濟(jì)南市鋼城區(qū)）某金銀花種植基地。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院郭慶梅教授鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica Thunb.的新鮮果實。

1.2 主要試劑與儀器

2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2-2聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海麥克林生化有限公司產(chǎn)品;抗壞血酸（VC，分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純。

儀表恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司生產(chǎn);Re-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);TU1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司生產(chǎn);SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，鄭州博科儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 忍冬果實活性成分提取 取新鮮摘取的忍冬果實2.5 kg，用95%乙醇冷浸提取2次，每次30天，抽濾，合并濾液，旋蒸濃縮得到無醇味浸膏，約1.41 kg。取部分浸膏用適量蒸餾水混懸后，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇溶液萃取至上層萃取液幾乎無色。合并相同萃取液，經(jīng)旋蒸濃縮、水浴蒸干揮干溶劑，分別得到忍冬果實三個極性部位的萃取物，其中石油醚及正丁醇部位呈稠膏狀，乙酸乙酯部位呈粉末狀，密封后置于冰箱冷藏備用。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定 參照文獻(xiàn)[9，10]的方法稍作調(diào)整。 配制濃度為0.1 mmol· L-1的DPPH無水乙醇溶液。以無水乙醇為溶劑，將不同極性部位的萃取物配制一系列不同濃度的待測樣品溶液，25℃暗處放置30 min，以517 nm為測定波長，以無水乙醇為參比溶液，測定吸光度值A(chǔ)，重復(fù)檢測3次，計算求得平均值作為結(jié)果。以抗壞血酸（VC）為陽性對照。按照下列公式計算自由基清除率（K）：

K =1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。

式中：Ai 為 2 mL DPPH 溶液加2 mL 待測溶液的吸光值;Aj 為 2 mL 待測溶液加2 mL 乙醇的吸光值;AC為 2 mL DPPH 溶液加2 mL 乙醇的吸光值。

1.3.3 還原Fe3+能力的測定 參照文獻(xiàn)[9，10]的方法稍作調(diào)整。將不同極性部位的萃取物配制一系列不同濃度的待測樣品溶液。取2.5 mL的不同待測樣品溶液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol·L-1， pH= 6.6）及2.5 mL的1% K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴中反應(yīng)20 min，急速冷卻，加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液。取反應(yīng)液5 mL，加入5 mL的蒸餾水和1 mL的0.1% FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后，以空白對照為參比溶液，于700 nm處測定吸光度值，重復(fù)檢測3次，計算求得平均值作為結(jié)果。以抗壞血酸作陽性對照。吸光度值越大表示還原能力越強(qiáng)。

1.3.4 總抗氧化能力的測定（FRAP法） 參照文獻(xiàn)[11]的測定方法并稍作調(diào)整。FRAP工作液配制：將0.2 mol·L-1醋酸鹽緩沖液（pH=3.6）、10 mmol·L-1 TPTZ（溶于40 mmol·L-1鹽酸）、20 mmol·L-1FeCl3三者按10∶1∶1的比例混合。TFRAP工作液需臨用前配制。

將不同極性部位的萃取物配制一系列不同濃度的待測樣品溶液。取600 μL待測樣品溶液和6 mL配置好的已預(yù)熱至37℃的FRAP工作液，混勻，10 min后測定吸光度A，以空白試劑作為參比溶液，以抗壞血酸做陽性對照。根據(jù)以上相同步驟，用不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.10 mg·mL-1）測定吸光度，以FeSO4的濃度為橫坐標(biāo)（V），以對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)（W），繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。把測得的樣品的吸光度A代入FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)的FeSO4濃度（mg·mL-1），并以樣品濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)的FeSO4濃度為縱坐標(biāo)（y），繪制回歸曲線。規(guī)定樣品的FRAP值與提取的每克干樣品中的FeSO4毫摩爾數(shù)（mmol·g-1干樣品） 等價。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除率分析

由表1可以看出，在忍冬果實不同極性部位樣品中，乙酸乙酯部位具有較顯著清除DPPH自由基的能力，石油醚和正丁醇部分的清除能力較弱。并且在一定范圍內(nèi)，三種不同極性部位溶液的清除率和濃度間有較好的線性關(guān)系，即樣品的清除能力與其自身濃度呈正相關(guān)，當(dāng)樣品濃度增長到一定值時，各部位的清除率上升緩慢或穩(wěn)定在一定值。當(dāng)清除率為50%時，乙酸乙酯部位的IC50值明顯小于VC，即其清除效果優(yōu)于相同體積的抗壞血酸。抗壞血酸及忍冬果實各極性部位對DPPH自由基的清除能力為：乙酸乙酯部位>VC>正丁醇部位>石油醚部位。

2.2 還原Fe3+能力的測定（還原力的測定）

由圖1可知，忍冬果實提取物各極性部位均表現(xiàn)出一定的對Fe3+的還原能力，但略有差異。各極性部位樣品的吸光度A隨溶液中樣品濃度的增長而增長，表明在一定試驗范圍內(nèi)，樣品的鐵還原能力與樣品濃度存在良好的線性關(guān)系，對Fe3+的還原力具有顯著的量效關(guān)系。乙酸乙酯部位的鐵還原能力最顯著，正丁醇部位次之，石油醚部位作用較弱?？箟难岷腿潭麑嵏魈崛〔课坏倪€原能力為：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。

2.3 總抗氧化能力的測定

本試驗得出FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為W =7.7597 V+0.0742，RSD=0.9990。由表2可以看出，不同極性部位的總抗氧化能力在一定范圍內(nèi)隨各樣品溶液濃度的增加而增強(qiáng)。乙酸乙酯部位萃取物的FRAP值較大，即對Fe3+還原能力強(qiáng)，石油醚部位和正丁醇部位的FRAP值較低。乙酸乙酯部位的FRAP值與抗壞血酸的較為接近，表明其所含抗氧化物質(zhì)活性較強(qiáng)或含有較多抗氧化活性物質(zhì)。經(jīng)計算可得，每克石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和 VC的抗氧化能力相當(dāng)于80.3、1 383.9、268.4、1 864.4 mg的硫酸亞鐵。FRAP值為0.5283、9.1046、1.7658、12.2658 mmol·g-1，因此抗壞血酸及忍冬果實不同極性部位總抗氧化能力為：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。

3 討論與結(jié)論

本試驗利用溶劑萃取法對忍冬果實醇提物的不同極性部位進(jìn)行初步分離，并對不同部位的抗氧化性能進(jìn)行研究。

由于不同抗氧化檢測方法的測定機(jī)理不同，為獲取可靠結(jié)論，本試驗分別利用DPPH自由基清除法、鐵氰化鉀法、FRAP法對分離得到的忍冬果實醇提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位的抗氧化能力進(jìn)行評價。綜合檢測結(jié)果得到忍冬果實的不同極性部位萃取物體外抗氧化活性為：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。

抗壞血酸作為經(jīng)典的抗氧化物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。本試驗以抗壞血酸作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除率、鐵還原力、總抗氧化能力與抗壞血酸接近，且對DPPH自由基的清除作用強(qiáng)于抗壞血酸，而正丁醇部位和石油醚部位和抗壞血酸數(shù)據(jù)差別較大，說明乙酸乙酯部位提取物含有相對含量較高或活性較強(qiáng)的具有抗氧化能力的物質(zhì)。試驗結(jié)果顯示忍冬果實醇提物的乙酸乙酯部位是其體外抗氧化的主要部位。目前，對忍冬果實乙酸乙酯部位提取物采用硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20等方法共分離鑒定出7種化合物，分別為熊果酸、齊墩果酸、原兒茶酸、苜蓿素、槲皮素、咖啡酸和木犀草苷[5]。有研究表明，黃酮類物質(zhì)槲皮素、木犀草苷及酚酸類物質(zhì)原兒茶酸、咖啡酸具有較高抗氧化活性，且具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的咖啡酸相對于其他酚酸類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[12]。分析顯示，黃酮類物質(zhì)槲皮素、木犀草苷及酚酸類物質(zhì)原兒茶酚酸、咖啡酸可能為忍冬果實具有抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗結(jié)果可以為忍冬果實的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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