胰蛋白酶提取豬皮中明膠的工藝優(yōu)化

張?jiān)气P，李嘉敏，王 平

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西太原030008）

隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，消耗的能源也越來(lái)越多，其中生物資源是一種優(yōu)質(zhì)的清潔能源，需要我們加大力度不斷開(kāi)發(fā)，將可以利用的清潔能源充分應(yīng)用到我們的生活中[1]。明膠作為膠原的水解產(chǎn)物，是一種可再生的動(dòng)物生物質(zhì)清潔能源，資源量正在不斷增加[2]。

然而傳統(tǒng)堿法提取制備明膠的工藝，在生產(chǎn)過(guò)程中的體系衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)控制較為困難，生產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)設(shè)備較難更新改進(jìn)，不符合綠色節(jié)能生產(chǎn)工藝的大環(huán)境要求[3]。酶法提取明膠雖然發(fā)展時(shí)間較短，卻在相關(guān)的國(guó)內(nèi)外研究中取得較大成果，雖然到目前為止還沒(méi)能大范圍應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，不過(guò)其提取時(shí)間較短，設(shè)備及反應(yīng)體系更環(huán)保及易控制，將是未來(lái)明膠提取工藝的重要發(fā)展方向[4]。因此，對(duì)酶法提取明膠的相關(guān)工藝進(jìn)行探討和總結(jié)具有一定的研究意義和實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

豬皮；胰蛋白酶（阿拉丁試劑公司）；明膠（阿拉丁試劑公司）；其他試劑均為分析純。

FA2104 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；JB300D 型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；恒溫水浴鍋（嘉興俊思電子有限公司）；TU190 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）；Spectrum 100 型FT-IR 紅外（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 豬皮的預(yù)處理

將新鮮豬皮洗凈，去除豬皮上帶有的脂肪，隨后將洗凈的新鮮豬皮切成1 cm×1 cm 小塊，使用濃度為2 mol/L 的氯化鈉溶液于1 000 mL 的燒杯中持續(xù)攪拌24 h，以除去豬皮中所含的鹽溶性及其他可溶性雜質(zhì)，取出后用去離子水清洗數(shù)次；再將處理后的豬皮在丙酮溶液里浸泡12 h 以去除豬皮中的脂類物質(zhì)[1]，浸泡之后取出并將其清洗干凈，放在室溫下自然風(fēng)干，待用。

1.3 明膠標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密稱取0.500 0、1.000 0、1.500 0、2.000 0 和2.500 0 g 的明膠標(biāo)準(zhǔn)品，在75℃的水浴中溶解于0.5 mol/L 醋酸溶液中，轉(zhuǎn)移至25 mL 的容量瓶中并用0.5 mol/L 的醋酸溶液定容，即分別得到濃度為2%、4%、6%、8%、10%的明膠標(biāo)準(zhǔn)溶液，單位為g/mL。取上述已配制好的溶液，以醋酸溶液為空白樣，在波長(zhǎng)280 nm 處使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)試[5]。以膠原濃度為橫坐標(biāo)，以280 nm 處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制吸光度曲線，得到回歸曲線方程。

1.4 胰蛋白酶法提取豬皮中的明膠

將處理后的豬皮浸泡于醋酸溶液中，加入胰蛋白酶，升溫反應(yīng)，酶解，然后，一定溫度下提取明膠。提取過(guò)程中，溶液中明膠的濃度采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)試的濃度與溶液體積的乘積比上實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)用到的干豬皮重量即得明膠的得率。

明膠的得率Yc由以下公式計(jì)算得到：

其中，Vc是明膠提取液的體積，mL；Cc是通過(guò)紫外法測(cè)得的明膠提取液的濃度，g/mL；Wt是提取使用的干豬皮的重量，g。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)步驟

本文探討的單因素為胰蛋白酶的用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、溶膠溫度。

1.5.1 胰蛋白酶用量

稱取4 份8 g 干豬皮加入到0.5 mol/L 醋酸溶液中，加入胰蛋白酶的用量分別為0.08 g、0.16 g、0.24 g、0.32 g，調(diào)節(jié)溶液pH 為7 左右，在35℃的水浴中攪拌12 h，后調(diào)節(jié)pH 為2～3，反應(yīng)2 h，使其鈍化，再調(diào)節(jié)pH 到7左右，升高溫度到75℃溶膠6 h，用濾布進(jìn)行過(guò)濾，去除未反應(yīng)完全的豬皮殘?jiān)?，用離心機(jī)離心后取上層清液于比色皿中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出胰蛋白酶不同用量下干豬皮中明膠的提取率。據(jù)此確定酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下的最優(yōu)胰蛋白酶用量。UV 測(cè)試同1.3。

1.5.2 酶解時(shí)間

酶解時(shí)間分別12 h、24 h、36 h、48 h，采用1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，溶膠溫度為75℃條件下的最優(yōu)酶解時(shí)間。

1.5.3 酶解溫度

酶解溫度為15℃、25℃、35℃、45℃的水浴條件下，采用1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.16 g，酶解時(shí)間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下的最優(yōu)酶解溫度。

1.5.4 溶膠溫度

溶膠溫度為70℃、75℃、80℃、85℃的條件下，采用

1.5.1 的方法確定胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為24 h 條件下的最優(yōu)溶膠溫度。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝

通過(guò)對(duì)單因素的結(jié)果進(jìn)行分析，將對(duì)明膠產(chǎn)率影響較大的因素進(jìn)行正交優(yōu)化，然后按照正交優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.7 紅外測(cè)試

打開(kāi)紅外測(cè)試儀的開(kāi)關(guān)并預(yù)熱0.5 h 左右，將實(shí)驗(yàn)所得明膠溶液小心地滴在樣品板上，蓋住蓋子掃描譜圖，得到譜圖后保存，完成后將檢測(cè)口用棉花沾取工業(yè)乙醇擦洗干凈[6]。仔細(xì)分析所得譜圖，得出結(jié)論。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到明膠濃度為2%、4%、6%、8%、10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度A，用0.5 mol/L 醋酸溶液作為空白對(duì)照，得出表1 數(shù)據(jù)。

以吸光度A 為縱坐標(biāo)，濃度C 為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得出明膠吸光度A 與濃度C 的關(guān)系曲線的回歸方程式為y=1.42x+0.009 8，R2=0.998 5。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖1 明膠吸光度A 與濃度C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 胰蛋白酶用量對(duì)工藝的影響

酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶的用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如表2。

表2 不同胰蛋白酶用量的提取率

圖2 不同胰蛋白酶用量的明膠提取率

圖2為不同胰蛋白酶用量的明膠提取率曲線，由圖2 可以看出，明膠提取過(guò)程中保持酶解溫度、酶解時(shí)間及溶膠溫度一定的情況下，胰蛋白酶用量為0.24 g，即豬皮干重3%（g/g）時(shí)明膠的提取率最為理想，在酶濃度較低時(shí)酶解效果不理想，當(dāng)酶濃度過(guò)高時(shí)提取率也降低。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶解時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如表3。

表3 不同酶解時(shí)間的提取率

圖3 不同酶解時(shí)間的明膠提取率

圖3為不同酶解時(shí)間的提取率曲線，由圖3 可知：提取過(guò)程中保持胰蛋白酶用量、酶解溫度及溶膠溫度一定的情況下，加入胰蛋白酶后反應(yīng)時(shí)間為24 h 時(shí)明膠的提取率最為理想，這是由于酶解時(shí)間太短，反應(yīng)進(jìn)行不完全；而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使膠原纖維遭到破壞。

2.4 酶解溫度對(duì)工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.16 g，酶解時(shí)間為12 h，溶膠溫度為75℃條件下，改變酶解溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如表4。

表4 不同酶解溫度的提取率

圖4 為不同酶解溫度的提取率曲線，由圖4 可知：保持胰蛋白酶用量、酶解時(shí)間及溶膠溫度一定的情況下，當(dāng)酶解溫度為35℃時(shí)明膠的提取率最為理想，可能是胰蛋白酶在這個(gè)溫度下活性最高。

2.5 溶膠溫度對(duì)工藝的影響

胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為24 h 的條件下，改變?nèi)苣z溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如表5。

圖4 不同酶解溫度的明膠提取率

表5 不同溶膠溫度的提取率

圖5 不同溶膠溫度的明膠提取率

由圖5 不同酶解溫度的提取率曲線分析可以得出：保持胰蛋白酶用量、酶解時(shí)間及酶解溫度一定的情況下，溶膠溫度為80℃時(shí)明膠的提取率最為理想。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

通過(guò)對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，對(duì)四個(gè)因素中對(duì)產(chǎn)率有較大影響的水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交助手共提供了九組組合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件排列如表6，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表7。

由以上分析結(jié)果可以看出，在胰蛋白酶用量為0.24 g，酶解溫度為35℃，酶解時(shí)間為24 h，溶膠溫度為80℃時(shí)，溶液的紫外吸光度A 為0.084，溶液明膠濃度為0.052 2 g/mL，胰蛋白酶對(duì)干豬皮的明膠的提取率為67.28%。

2.7 明膠的紅外譜圖和分析

紅外光譜能充分反映官能團(tuán)與波長(zhǎng)的關(guān)系，其實(shí)質(zhì)是一種根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對(duì)振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息來(lái)確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和鑒別化合物的分析方法[7]。明膠的FT-IR 譜圖可以反映蛋白質(zhì)骨架和側(cè)鏈基團(tuán)的特征吸收峰位置及基團(tuán)的振動(dòng)模式，并由此推測(cè)其構(gòu)象[8]。

表6 正交實(shí)驗(yàn)排列表

表7 正交實(shí)驗(yàn)下的提取率

圖6 明膠標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖

明膠標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖如圖6，由圖6 可知：在標(biāo)準(zhǔn)圖中，明膠有四個(gè)特征吸收峰，分別為3 295 cm-1，2 927cm-1，1 636～1 661 cm-1和1 450～1 230 cm-1，他們分別對(duì)應(yīng)酰胺A 帶、酰胺B 的N-H 伸縮振動(dòng)，酰胺I 的C=O 伸縮，酰胺Ⅱ的C-N 伸縮、N-H 彎曲[7]。圖7 為明膠產(chǎn)品的紅外譜圖，由圖7 可以看出，3 366 cm-1和2 928 cm-1附近是N-H 伸縮振動(dòng)，1 638 cm-1附近是酰胺I 帶的C=O 伸縮振動(dòng)，1 257cm-1是N-H 彎曲振動(dòng)[7,9]，說(shuō)明產(chǎn)品為明膠。

圖7 明膠產(chǎn)品的紅外譜圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶法提取明膠，研究了胰蛋白酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度及溶膠溫度四個(gè)單因素對(duì)明膠提取率的影響，并對(duì)影響提取率較大的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)的工藝條件為：酶用量為3%，酶解時(shí)間12 h，酶解溫度35℃，溶膠溫度80℃，該條件下明膠提取率為67.28%。