第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶活性和微生物量的影響

王趁義, 陳仙仙, 黃兆瑋, 付佳佳, 汪少奇

(1.浙江萬里學(xué)院, 生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315100; 2.寧波晟乾環(huán)境技術(shù)開發(fā)有限公司, 浙江 寧波 315100)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，幾乎所有的土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)都直接或間接地與土壤微生物有關(guān)，土壤微生物參數(shù)變化將有可能成為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)[1]。其中的細(xì)菌、真菌和放線菌不僅是土壤有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是植物營養(yǎng)元素的活性庫[2]。因此土壤微生物在有機質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)、肥力形成、污染物降解以及能量流動方面具有重要的作用[3-5]。另外由于微生物生長繁殖的最適溫度、濕度及養(yǎng)分條件與植物相似，故可以綜合反映土壤肥力和環(huán)境質(zhì)量狀況[6]。尿素作為主要的化學(xué)氮肥品種，約占氮肥消耗總量60%以上，然而在生產(chǎn)實踐中我國水稻、玉米、小麥三大糧食作物氮肥的當(dāng)季平均利用率僅為33%，遠(yuǎn)低于美國、歐洲糧食作物的氮肥利用率(分別為50%，65%左右)[7]。主要原因是土壤中的脲酶能將尿素迅速催化水解成NH3，其速率是未經(jīng)催化水解的1014倍[7]，極大地降低了動植物對氮素的利用，而我國每年因氮肥利用率低下導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)450億元[8]。尿素的快速分解，不僅造成農(nóng)業(yè)資源的嚴(yán)重浪費，同時也會引起一系列的生態(tài)環(huán)境問題[8-9]，如導(dǎo)致植物“燒苗”[10]；引起嚴(yán)重的環(huán)境氮污染和農(nóng)村面源污染[11]；加速土壤酸化、耕地板結(jié)的進(jìn)程[12]；造成大氣污染，比如溫室效應(yīng)[13]，臭氧層破壞[14]等。因此，如何在保障土壤供肥能力的同時，提高氮肥利用率，減少氮肥引起的環(huán)境污染和生態(tài)效應(yīng)，已成為一個世界性研究課題[8,15-16]。脲酶活性的抑制劑調(diào)控技術(shù)已成為提高尿素利用率最有效的生物化學(xué)方法。但現(xiàn)有的3類脲酶抑制劑中，金屬鹽類毒性較大；有機類的則因高殘留、有耐藥性、有效抑制時間短等原因，難以被大范圍推廣應(yīng)用；而植物源類抑制劑有效成分小、藥效慢、植物的采集具有季節(jié)性等缺點不易為農(nóng)民接受[7]?；谇?類脲酶抑制劑的弊端，目前新型高效綠色的配合物型脲酶抑制劑(以下簡稱第四類抑制劑)已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[8]，尤其是Schiff堿配合物型，因其結(jié)構(gòu)中N原子上含有孤對電子，毒性小，與金屬離子的配位能力較強，可以與多種過渡金屬離子形成配合物，表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌、抗癌、抑制脲酶活性，有望成為一類性能優(yōu)良的新型脲酶抑制劑[8,17]。但其施加后對土壤環(huán)境的影響還鮮有報道，只有在探明其對土壤影響的基礎(chǔ)上方可推廣應(yīng)用于大田作物生產(chǎn)或肥料企業(yè)。郭晨[18]認(rèn)為土壤微生物的數(shù)量與土壤肥力存在正比例關(guān)系，通過測量土壤微生物的多少就能夠知道土壤肥力以及肥料、農(nóng)藥或者進(jìn)入土壤中的外來化學(xué)物質(zhì)對土壤狀況的影響，這種方式相較于正常的化學(xué)測定方式而言更為便捷與高效。目前，針對第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶活性和土壤微生物生長影響的研究報到極少，僅有的一些研究也只報道了一些傳統(tǒng)的脲酶抑制劑如N-丁基硫代磷酰三胺(nBPT)[19]、氫醌(HQ)[20]、腐植酸[21-22]等對土壤微生物類群分布、土壤酶活性及土壤微生物種類和數(shù)量的影響。本文的研究結(jié)果能為第四類脲酶抑制劑的安全性評價及相關(guān)脲酶抑制劑產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

第四類脲酶抑制劑來自項目組前期合成的Schiff堿銅配合物型抑制劑，化學(xué)式C14H15N3O6Cu[23]；尿素(N≥46%)購于國藥集團(tuán)有限公司；供試土壤采自寧波市鄞州區(qū)首南街道月浦稻田的水稻土，按5點法采取5—20 cm層土樣，風(fēng)干、混勻、研磨，過2 mm篩備用。土壤基本理化性質(zhì)為：水分含量32.2%，pH值6.7，有機質(zhì)14.5%，全氮2.26 g/kg，硝態(tài)氮0.77 mg/kg，銨態(tài)氮3.58 mg/kg，有效磷62.96 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

取500 g風(fēng)干土樣于若干個10 cm×14 cm培養(yǎng)容器中，調(diào)節(jié)土樣的含水量至田間持水量的60%，然后置于28 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)1周以恢復(fù)生物活性，并定期攪拌土壤，保持土壤通氣性。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將上述土壤分成5組，第1組為空白(K)，第2組僅加入5 g尿素(U)，第3—5組分別加入尿素和尿素量的0.1%，0.5%和1%的第四脲酶抑制劑，所組成的混合物分別記作UI 0.1%，UI 0.5%和UI 1%。各組所加肥料均溶于水之后再施用，每個處理3次重復(fù)。然后將上述試驗組置于20 ℃的人工氣候箱中于4月18號開始培養(yǎng)，4月24號開始取樣并且每隔6 d取樣測定一次微生物數(shù)量和土壤脲酶活性，總共取樣7次于5月31號結(jié)束，試驗期間每天通過稱重法加1次水以保持土壤含水量不變。

1.3 測定項目與方法

土壤脲酶活性測定采用靛酚藍(lán)比色法[24]；土壤微生物的計數(shù)采用采用稀釋涂平板計數(shù)法[25]。稱取土樣1 g，放入盛有99 ml無菌水的三角瓶中振蕩20 min，使土樣與水充分混合，制成10-2土壤懸液。用無菌吸管從中吸取1 ml土壤懸液加入盛有9 ml無菌水的試管中充分混勻，以此類推制成10-2，10-3，10-4，10-5等不同稀釋度的土壤懸液。然后用無菌吸管各吸取不同稀釋度的土壤懸液0.2 ml對號放入已制好的平板培養(yǎng)基中。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，稀釋梯度選用10-5，10-6，10-7；放線菌采用高氏Ⅰ號培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，稀釋梯度選用10-3，10-4，10-5；真菌采用虎紅瓊脂培養(yǎng)基于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，稀釋梯度選用10-2，10-3，10-4[26]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

土壤微生物數(shù)量計算公式為：每克土壤樣品菌數(shù)=某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶活性的影響

抑制劑不同施用濃度對脲酶活性的影響如圖1所示。由圖1可見，尿素表施到土壤后，U，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%處理土壤脲酶活性逐漸增強，在第12 d土壤脲酶活性達(dá)到最大，而空白處理的土壤脲酶活性基本不變，這表明尿素在早期能夠被土壤中的脲酶快速分解成碳酸銨。在脲酶抑制劑的作用下，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%處理組在第12 d，24 d和第36 d土壤脲酶活性受到了顯著抑制，其中UI 1%處理的土壤脲酶活性在第12 d，24 d和36 d分別比僅加尿素處理組降低了22.1%，32.2%和40.8%，第36 d UI 1%處理和僅加尿素處理達(dá)到顯著差異(p<0.05)，說明此類脲酶抑制劑的抑制作用施用后期大于施用前期，這可能與抑制劑本身穩(wěn)定性有關(guān)，由于Schiff堿金屬配合物是由Schiff堿配體和金屬銅離子配位反應(yīng)合成的，它的熱穩(wěn)定性會比一般有機物要好一點，因此普通脲酶抑制劑在前期幾天就分解完了而第四類脲酶抑制劑在后期還能繼續(xù)作用，但是具體作用機制有待進(jìn)一步深入研究。而UI 0.5%和UI 0.1%處理對土壤脲酶活性的抑制率低于UI 1%處理，這表明了當(dāng)抑制劑的濃度配比達(dá)到了1%時，對土壤脲酶活性抑制效果最好。U，UI 0.1%，UI 0.5%，UI 1%的土壤脲酶活性在第12 d之后開始下降并在第42 d之后基本一致，表明了第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶活性的抑制時效性達(dá)42 d。

2.2 第四類脲酶抑制劑對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

第四類脲酶抑制劑對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響如圖2所示。5個處理組的土壤細(xì)菌數(shù)在培養(yǎng)第6 d時差別不大(2.00×107)，第6 d之后都有不同程度的增加，其中UI 1%和UI 0.5%處理組較僅加尿素處理增加的幅度較大，而UI 0.1%處理與僅加尿素處理的細(xì)菌數(shù)差別不大。12 d之后UI 0.1%和UI 0.5%處理組的土壤細(xì)菌增長數(shù)量基本一致。各處理的土壤細(xì)菌數(shù)在第24 d達(dá)到最大，之后逐漸減少并在第42 d達(dá)到與空白組細(xì)菌一樣的數(shù)量。在整個培養(yǎng)期間，空白組細(xì)菌一直處于較低水平。僅加尿素處理的土壤細(xì)菌數(shù)比空白處理土壤的細(xì)菌數(shù)多，表明了尿素對土壤細(xì)菌生長有促進(jìn)作用，最大增長率為63.6%。與空白處理組細(xì)菌數(shù)量相比得出的第四類脲酶抑制劑處理組細(xì)菌增長率明顯超過了僅加尿素處理組，其最大增長率為86.2%，這主要與以下兩個原因有關(guān)，一個原因是脲酶抑制劑可以減少尿素水解產(chǎn)生的高濃度氨和銨對細(xì)菌生長的脅迫作用，另外能夠保證后期有足夠的碳源和氮源供細(xì)菌生長[27-28]。另一個原因是脲酶抑制劑的加入使細(xì)菌生長環(huán)境發(fā)生了變化(pH值升高、滲透壓增加、脲酶活性降低等)，給細(xì)菌提供了一個良好的生長環(huán)境。UI 0.1%和UI 0.5%處理的土壤細(xì)菌數(shù)量趨向一致，明顯低于UI 1%處理的土壤細(xì)菌數(shù)量，對比圖1與相應(yīng)濃度處理的土壤脲酶活性差距相一致，因此可以得出這可能與抑制抑制土壤脲酶活性強弱有關(guān)。在培養(yǎng)第42 d時，各處理的土壤細(xì)菌數(shù)達(dá)到一致，說明尿素已全部水解，不再為細(xì)菌生長提供碳源和氮源。

圖2 第四類脲酶抑制劑對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

2.3 第四類脲酶抑制劑對土壤放線菌數(shù)量的影響

第四類脲酶抑制劑對土壤放線菌數(shù)量的影響如圖3所示，各處理的土壤放線菌數(shù)量變化規(guī)律大致相同，先上升后下降最后趨于平穩(wěn)。土壤放線菌數(shù)量在第18 d達(dá)到最高值，在第30 d趨于平穩(wěn)。在第42 d，施用脲酶抑制劑處理組的放線菌數(shù)量與僅加尿素處理組放線菌數(shù)量趨向一致，而空白組的放線菌數(shù)量遠(yuǎn)高于其它4個處理組的放線菌數(shù)量?？瞻捉M的放線菌數(shù)量在整個培養(yǎng)期間要遠(yuǎn)高于僅加尿素處理組的放線菌數(shù)量，這說明尿素對放線菌的生長有抑制作用，最大抑制率達(dá)46.4%。3種加了第四類脲酶抑制劑的處理組放線菌數(shù)量要高于僅加尿素組放線菌的數(shù)量，其中在第12 d和第18 d，UI 0.5%，UI 1%處理組和僅加尿素組達(dá)到顯著差異(p<0.05)，說明第四類脲酶抑制劑對放線菌的生長有顯著促進(jìn)作用。

圖3 第四類脲酶抑制劑對土壤放線菌數(shù)量的影響

2.4 第四類脲酶抑制劑對土壤真菌數(shù)量的影響

第四類脲酶抑制劑對土壤真菌數(shù)量的影響如圖4所示，在整個培養(yǎng)期間，UI 1%處理組真菌的數(shù)量要高于其它4個處理組真菌的數(shù)量。UI 1%處理組真菌的數(shù)量在第6 d后有一個較大幅度的升高，而其它4個處理組的真菌數(shù)量在第18 d后才有一個較大幅度的增長。各個處理組的真菌數(shù)量在第24 d達(dá)到生長高峰期，之后開始下降，其中U，UI 0.1%，UI 0.5%處理組真菌數(shù)量在第42 d與空白組真菌數(shù)量趨向一致。僅加尿素處理組的真菌數(shù)量比其它幾組真菌數(shù)量要低，表明尿素抑制了土壤真菌的生長，最大抑制率達(dá)89.7%。UI 0.1%和僅加尿素處理組的真菌數(shù)量基本相同，說明低濃度的抑制劑對土壤真菌生長沒有太大的影響，當(dāng)抑制劑濃度繼續(xù)增大，土壤真菌數(shù)量相較于僅加尿素處理組有一個較大的增長，UI 0.5%處理組最大增長率為46.9%，UI 1%處理組最大增長率為83.6%，由此說明第四類脲酶抑制劑的加入能夠促進(jìn)土壤真菌的生長。在第42 d，U，UI 0.1%，UI 0.5%處理組和空白處理組的土壤真菌增長率趨向一致說明尿素已基本水解完全，UI 1%處理組真菌的數(shù)量在第42 d有一個小幅度的增長，說明高濃度的第四類脲酶抑制劑抑制土壤脲酶活性時效性比較長，能延長對土壤真菌的影響。

圖4 第四類脲酶抑制劑對土壤真菌數(shù)量的影響

3 討 論

土壤脲酶活性受到諸多因素的影響，與基質(zhì)濃度、溫度、pH值、有機質(zhì)含量等因素相關(guān)，在一定時間內(nèi)可被脲酶抑制劑所抑制[29-30]。研究表明，施加第四類脲酶抑制劑處理的抑制效果都是隨施用時間的延長而增強，抑制活性在第36 d達(dá)到最強，施入的后期作用大于前期，這與其它類別的脲酶抑制劑的研究結(jié)果不一致。趙略[31]研究結(jié)果表明第二類脲酶抑制劑nBPT的抑制效果隨施用時間的延長而減弱，施入的前期作用大于后期，抑制劑對脲酶的抑制活性在抑制劑施入后的第10 d達(dá)到最強，這說明與第二類脲酶抑制劑相比，第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶活性抑制的時效性明顯延長，這可能是由于第四類抑制劑的兩種組合單元(Schiff堿配體、植物生長必需的金屬元素)被限制在配合物骨架中，同時擁有了雙活性位點的原因，兼具了無機和有機功能基團(tuán)各自的性質(zhì)和功能，從而使它作用時間延長，毒性大為降低[32]。然而，這些認(rèn)知只是停留在理論意義上，尚需進(jìn)一步地進(jìn)行試驗驗證。

土壤脲酶主要來源于土壤當(dāng)中的一些菌體[33]，第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶的抑制活性隨著抑制劑濃度的增大而增強，抑制劑濃度為1%的抑制作用要遠(yuǎn)高于抑制劑濃度為0.5%和0.1%。土壤脲酶主要來源于土壤中的一些微生物菌體[32]，第四類脲酶抑制劑對土壤脲酶的抑制活性隨著抑制劑濃度的增大而增強，抑制劑濃度為1%的抑制作用要遠(yuǎn)高于抑制劑濃度為0.5%和0.1%。主要原因是由于土壤脲酶為誘導(dǎo)酶，底物濃度對酶活性影響較大。在脲酶蛋白合成過程中，第四類脲酶抑制劑降低了底物對脲酶合成的誘導(dǎo)和促進(jìn)作用，從而阻礙了酶的活性中心形成[29]。

土壤微生物是土壤生物中最活躍的部分，他們參與土壤的有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)合成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和土壤的發(fā)育及形成，既是土壤中營養(yǎng)元素的“源”，又是營養(yǎng)元素的“庫”。施肥后，由于肥料在土壤中要分解(有機肥)或溶解(化肥)成更小的分子或離子，就形成了局部高濃度現(xiàn)象，這些短時間內(nèi)產(chǎn)生的局部高濃度會對土壤微生物產(chǎn)生明顯的影響。但土壤3大微生物對尿素的敏感程度不一樣，其中土壤放線菌和土壤真菌對尿素比較敏感，尿素會抑制其生長，這可能與尿素水解產(chǎn)生的銨過度累積有關(guān)。Arnebrandt等[34]的研究表明，施用氮肥對土壤微生物群落特別是菌根真菌有直接的抑制作用，其機制是抑制酶活力和積累毒性化合物。而細(xì)菌相反，尿素可促進(jìn)其生長，這可能與尿素水解產(chǎn)生的氮源類物質(zhì)會給細(xì)菌生長提供氮源和碳源有關(guān)。

在土壤的3大微生物群體中，第四類脲酶抑制劑對土壤放線菌的生長影響作用較小，對土壤真菌的生長影響較大，對土壤細(xì)菌的影響最大。有研究表明土壤中細(xì)菌數(shù)量的增加有利于土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，能為植物的生長提供良好的環(huán)境，土壤中放線菌數(shù)量的增加不僅能轉(zhuǎn)化土壤有機質(zhì)，對植物的土傳病原菌也起到一定的拮抗作，促進(jìn)土壤微生物區(qū)系向健康方向發(fā)展[35]。探討第四類脲酶抑制劑對土壤微生物的影響，對于實現(xiàn)化肥零增長，發(fā)展綠色和生態(tài)農(nóng)業(yè)的戰(zhàn)略需求具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

(1) 第四類脲酶抑制劑濃度為1%對土壤脲酶活性的抑制作用遠(yuǎn)高于抑制劑濃度為0.5%和0.1%，最大抑制率達(dá)40.8%，可以實現(xiàn)適度調(diào)控的目的。

(2) 尿素對土壤細(xì)菌生長有促進(jìn)作用，最大促進(jìn)率達(dá)83.6%；對真菌和放線菌有抑制作用，最大抑制率分別為89.7%，46.4%。

(3) 第四類脲酶抑制劑能夠促進(jìn)土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的生長，抑制劑濃度為1%時促進(jìn)作用最明顯。綜合不同濃度抑制劑對土壤脲酶抑制活性的強弱，可以得出第四類脲酶抑制劑施用濃度為1%是最佳用量。