輻射對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞干細(xì)胞表型表達(dá)影響

姜 曈， 李菁菁， 石 梅

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射治療科，陜西 西安 710032

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)在東南亞、中國(guó)南部流行，是一種高風(fēng)險(xiǎn)的頭頸部腫瘤，具有高度的放射敏感性[1]。放射治療(radiotherapy，RT)能有效控制早期NPC，且預(yù)后良好，對(duì)Ⅰ期及ⅡA期患者的5年總存活率分別為90%、84%[2]。然而，部分NPC患者在治療后仍會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而RT可能促進(jìn)這些惡性進(jìn)程。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)位于腫瘤異質(zhì)性的頂端，除本身的致瘤潛能，其對(duì)包括RT在內(nèi)的傳統(tǒng)抗癌治療方式具有抗性，可導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。CSCs可自發(fā)地從正常和腫瘤性的非干細(xì)胞中產(chǎn)生，表明干細(xì)胞和非干細(xì)胞狀態(tài)之間存在雙向的相互轉(zhuǎn)化[3]。有研究報(bào)道，電離輻射(ionizing radiation，IR)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成類似干細(xì)胞生物學(xué)特征的表型，即CSCs表型[4-11]。本研究根據(jù)NPC的臨床RT方式，模擬其分割療法，建立IR后NPC殘癌細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)NPC殘癌細(xì)胞的成球能力及干細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)，探討輻射對(duì)NPC干細(xì)胞表型表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人NPC的CNE-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、RIPA裂解液(強(qiáng))、Tween?20購(gòu)自北京索萊寶；八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)引物、性別決定區(qū)Y框蛋白2 (SRY related HMG box-2,SOX2)引物、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,Klf4)引物、β-actin引物由北京奧科合成；總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購(gòu)自北京天根；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白預(yù)染marker購(gòu)自美國(guó)Thermo；5倍Loading Buffer購(gòu)自西安赫特；蛋白凝膠試劑盒購(gòu)自武漢博士德；脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)Difco；兔單克隆抗體OCT4、KLF4、SOX2購(gòu)自美國(guó)Abcam；鼠單抗β-Actin購(gòu)自美國(guó)CST；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Pioneer；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Milipore；人FGF生長(zhǎng)因子、人EGF生長(zhǎng)因子購(gòu)自美國(guó)Peprotech；N2 Supplement、B27 Supplement購(gòu)自美國(guó)Gibco；青霉素/鏈霉素混合液購(gòu)自美國(guó) Invitrogen。

1.2 儀器與耗材 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus；臺(tái)式常溫離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購(gòu)自Bioneer；倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad；24孔超低吸附培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning； 細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Eppendorf；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore。輻射源為60鈷(60Co)，由空軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心提供。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10% FBS的1640培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。

1.3.260Co γ射線照射 在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至40%～50%瓶底面積時(shí)，模擬臨床腫瘤RT的分割療法，單次照射劑量為2 Gy，劑量率1 Gy/min，連續(xù)隔日照射。連續(xù)4次照射CNE-1細(xì)胞獲得殘癌細(xì)胞株E-R4；連續(xù)7次照射CNE-1細(xì)胞獲得殘癌細(xì)胞株E-R7。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使用總RNA提取試劑盒，按照天根DP419說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。使用NanoDrop 2000在260 nm和280 nm處檢測(cè)提取的RNA樣品純度及濃度。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，按照天根KR116說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑，按照天根FP205說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列如下：OCT4上游(5，-GTGGAGAGCAACTCCGATG-3，)，下游(5，-TGCTCCAGCTTCTCCTTCTC-3，)；KLF4上游(5，-CCGCTCCATTACCAAGAGCT-3，)，下游(5，-ATCGTCTTCCCCTCTTTGGC-3，)；SOX2上游(5，-CGAGTGGAAACTTTTGTCGGA-3，)，下游(5，-TGTGCAGCGCTCGCAG-3，)；β-actin上游(5，-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3，)，下游(5，-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3，)。以β-actin snRNA作為實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)OCT4、KLF4和SOX2表達(dá)水平的內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算各組細(xì)胞間的表達(dá)差異。

1.3.4 成球?qū)嶒?yàn) 配置懸浮成球培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)液，1% N2，2% B27，1%雙抗，20 ng/ml FGF，20 ng/ml EGF)。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，離心5 min；吸棄上清，加入3 ml懸浮成球培養(yǎng)液，離心5 min(重復(fù)2遍)；吸棄上清，加入2 ml懸浮成球培養(yǎng)液后計(jì)數(shù)。用懸浮成球培養(yǎng)液進(jìn)行等比稀釋，2 000個(gè)/孔，1 ml/孔，種于超低附的24孔培養(yǎng)板。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。吸凈超低附培養(yǎng)板中培養(yǎng)液和細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。PBS清洗超低附培養(yǎng)板板孔，清洗后液體同樣收集于離心管中(重復(fù)1遍)；離心5 min，重新加入懸浮成球培養(yǎng)液1 ml，吹打細(xì)胞沉淀10次，重新轉(zhuǎn)移回原始超低附培養(yǎng)板板孔中，常規(guī)培養(yǎng)。每3 d更換1次懸浮成球培養(yǎng)液。超低附板培養(yǎng)10～15 d后，置于顯微鏡觀察、拍攝并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成球的大小、數(shù)量。

1.3.5 免疫印跡 將細(xì)胞接種于25 m2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶置于冰上，加入強(qiáng)RIPA裂解液，冰上裂解30 min。細(xì)胞刮刷刮取并收集細(xì)胞，4℃ 12 000 g離心15 min，吸取部分上清，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，剩余上清加入1/4體積的5倍Loading Buffer，金屬浴100℃加熱5 min；配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，20 μg蛋白樣本/泳道，恒壓電泳，上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V；恒流轉(zhuǎn)膜，電流200 mA濕轉(zhuǎn)120 min；用含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉PVDF膜1 h，封閉后洗膜3次，每次5 min。TBST稀釋一抗OCT4(1∶1 000)、KLF4(1∶1 000)、SOX2(1∶1 000)、β-Actin(1∶1 000)，孵育4℃過(guò)夜。次日清洗PVDF膜3次，5 min/次。TBST稀釋二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h 。孵育后用TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光液，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。以β-Actin為內(nèi)參，通過(guò)Image J軟件計(jì)算條帶的灰度值，比較細(xì)胞間OCT4、KLF4和SOX2表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

2.1 成球?qū)嶒?yàn) 成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，照射后，E-R4、E-R7的成球體積較親本CNE-1細(xì)胞增大，見(jiàn)圖1。照射后，E-R4、E-R7成球數(shù)量分別為(51.7±2.5)個(gè)、(69.7±0.6)個(gè)，明顯高于親本CNE-1細(xì)胞的(37.0±2.0)個(gè)，且E-R7成球數(shù)量高于E-R4，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果(100倍，a.親本CNE-1細(xì)胞；b.E-R4；c.E-R7)

2.2 NPC細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)情況比較 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示，E-R4、E-R7細(xì)胞中SOX2、OCT4及KLF4的mRNA表達(dá)水平較親本CNE-1細(xì)胞明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。免疫印跡結(jié)果顯示，E-R4、E-R7細(xì)胞中SOX2、OCT4及KLF4的蛋白表達(dá)水平較親本CNE-1細(xì)胞明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

表1 NPC細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與親本CNE-1細(xì)胞比較，①P<0.05

3 討論

RT是治療惡性腫瘤的主要手段之一，但有臨床研究表明，亞致死劑量的IR反而促進(jìn)癌癥的惡性表型，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)[12-13]。雖然這一效應(yīng)的機(jī)制尚未被完全解析，但反映出IR對(duì)具有輻射抗性的腫瘤細(xì)胞的選擇性擴(kuò)增，或在顯露于亞致死劑量輻射后獲得對(duì)輻射的耐藥性。CSCs是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)亞群，可在放療后存活，并在治療結(jié)束后重新開(kāi)始增殖，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[14-15]。包括CSCs在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜顯示，CSCs可能具有胚胎干細(xì)胞樣的未成熟基因表達(dá)特征[16-18]。此外，CSCs還可通過(guò)改變自身代謝、調(diào)節(jié)微環(huán)境變化、逃避免疫監(jiān)控、激活抗凋亡通路等方式適應(yīng)RT引起的苛刻條件。

表2 NPC細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物蛋白相對(duì)表達(dá)量

注：與親本CNE-1細(xì)胞比較，①P<0.05

圖2 NPC細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)量

本研究根據(jù)NPC的臨床RT方式，模擬其分割療法，通過(guò)連續(xù)4次和7次60Co γ射線照射CNE-1細(xì)胞，獲得CNE-1殘癌細(xì)胞株。成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，照射后，E-R4、E-R7的成球體積較親本CNE-1細(xì)胞增大，E-R4、E-R7成球數(shù)量明顯高于親本CNE-1細(xì)胞，且E-R7成球數(shù)量高于E-R4，提示連續(xù)多次照射可提高CNE-1細(xì)胞成球能力，且呈劑量依賴趨勢(shì)。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與免疫印跡結(jié)果顯示，E-R4、E-R7細(xì)胞中SOX2、OCT4及KLF4的表達(dá)水平較親本CNE-1細(xì)胞明顯提高，提示多次60Co γ射線照射可提高CNE-1細(xì)胞中干細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)。

SOX2、OCT4、KLF4共同形成多能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些基本轉(zhuǎn)錄因子的相互作用完成了胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能狀態(tài)[19-21]。SOX2在維持干細(xì)胞狀態(tài)、譜系決定以及神經(jīng)外胚層的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[22-23]。Gen等[24]對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系DNA的變化進(jìn)行研究，并檢測(cè)到SOX2基因的擴(kuò)增。對(duì)于肺癌，SOX2促進(jìn)細(xì)胞增殖，而SOX2敲除可逆轉(zhuǎn)這些作用[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，輻射抵抗的宮頸癌和化療抵抗的口腔鱗癌患者OCT4表達(dá)水平升高[27-28]。過(guò)表達(dá)OCT4的黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)更快，對(duì)缺氧和順鉑治療耐受性更強(qiáng)[29-30]。有研究表明，KLF4在原發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中有高表達(dá)[31-33]。此外，KLF4的致癌作用是早期乳腺癌和皮膚癌的預(yù)后較差的因素之一[34-35]。本研究有助于闡明CSCs的生物學(xué)原理以及開(kāi)發(fā)潛在的治療干預(yù)手段，解除CSCs的防御機(jī)制，使其對(duì)輻射治療引發(fā)的細(xì)胞死亡更敏感。此外，通過(guò)阻斷維持信號(hào)直接抑制CSCs可減少耐輻射亞群。直接或間接使CSCs對(duì)輻射敏感的藥物已在研究中，未來(lái)或有望加強(qiáng)臨床RT的效果。

綜上所述，2 Gy60Co γ射線連續(xù)照射可通過(guò)誘導(dǎo)SOX2、OCT4及KLF4提高鼻咽癌CNE-1細(xì)胞干細(xì)胞表型的表達(dá)。目前，RT的使用仍根據(jù)手術(shù)的類型和癌癥的分期制定。為達(dá)到選擇對(duì)RT有明顯效果患者的目的，需更深入的研究IR反應(yīng)的潛在預(yù)測(cè)因子，尋找可靠的IR反應(yīng)預(yù)測(cè)方法。