皮層肌動(dòng)蛋白絡(luò)氨酸磷酸化對(duì)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌發(fā)展研究

申英姬， 陳海月

1.大連市婦女兒童醫(yī)療中心 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116010；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，吉林 延吉 133000

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的婦科常見惡性腫瘤之一，病死率較高[1]。Src家族相關(guān)基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和細(xì)胞遷移等許多重要生理過程[2-3]。而Src在各種類型的癌癥尤其是轉(zhuǎn)移性病變中，可過度活化。皮層肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞Src激酶的一種常見底物，由皮層肌動(dòng)蛋白基因編碼，其基因位于人染色體11q13。皮層肌動(dòng)蛋白的過表達(dá)可在多種癌癥中檢測(cè)，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。皮層肌動(dòng)蛋白酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)的重要途徑。Src可在體外催化皮層肌動(dòng)蛋白肽鏈中3個(gè)絡(luò)氨酸殘基Tyrosine421(Tyr421)、Tyrosine466 (Tyr466)和 Tyrosine482(Tyr482)的磷酸化，并參與整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)散及粘附。

磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白在癌癥中起重要作用。皮層肌動(dòng)蛋白的Tyr421、Tyr466和Tyr482的磷酸化可在多種腫瘤細(xì)胞中觀察到，并在細(xì)胞的遷移過程中起關(guān)鍵作用[6]。在胃癌細(xì)胞，敲低皮層肌動(dòng)蛋白可使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性降低，而野生型皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)可使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性恢復(fù)，但Tyr421、Tyr466和Tyr482磷酸化位點(diǎn)突變的皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)無法恢復(fù)細(xì)胞移動(dòng)性[7]。本研究旨在探討皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白下調(diào)對(duì)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究選取11例正常宮頸組織標(biāo)本，61例不典型增生標(biāo)本，116例宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本購自Pantomics (美國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫化學(xué)染色 利用CTTN (美國(guó)Abcam公司),phospho-Tyr421-CTTN (美國(guó)LifeSpan BioScience公司)和phospho-Tyr466-CTTN (美國(guó)LifeSpan BioSciences公司)多克隆抗體進(jìn)行研究?？梢暬褂?,3′-二氨基聯(lián)苯胺，染色使用蘇木精。滴加一抗前，組織切片脫蠟至水，利用過氧化氫及甲醇復(fù)合物阻斷內(nèi)源性過氧化物酶并進(jìn)行抗原修復(fù)。宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞在腔室載玻片中培養(yǎng)過夜，磷酸緩沖液洗滌，70%乙醇固定，常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株HeLa及Siha源自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫,細(xì)胞株用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基置于37℃，5% CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。CTTN-shRNA及空白對(duì)照序列控制病毒購自美國(guó)Origene公司，轉(zhuǎn)染后，嘌呤霉素篩選，建立CTTN 敲除穩(wěn)定細(xì)胞株HeLa△CTTN及Siha△CTTN。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 利用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA,再利用1 μg總RNA 及 AccuPower?RT PreMix (韓國(guó)Bioneer公司)合成cDNA。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)用1X SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó)Applied Biosystems公司)在ABI7500 Real Time PCR 系統(tǒng)下進(jìn)行。內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物為：5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′，5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′。MKI67引物為：5′-CCCCCACCAGAACTAACAGA-3′，5′- ACTTTGATGCCCTCATCACC-3′。PCNA引物為：5′-GAAGCACCAAACCAGGAGAA-3′，5′-TCACTCCGTCTTTTGCACAG-3′。

1.2.4 體外增殖、劃痕及侵襲實(shí)驗(yàn) 本研究利用 HeLa△CTTN及Siha△CTTN細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，各組細(xì)胞接種到96孔板 (1×104個(gè)/孔)進(jìn)行培養(yǎng)，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行比較。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。利用HeLa△CTTN、Siha△CTTN細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，各組細(xì)胞接種到24孔板(1×104個(gè)/孔)常規(guī)培養(yǎng)過夜。第2天用200 μl微量移液槍頭在24孔板內(nèi)垂直劃痕，用磷酸緩沖液及培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，加入培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)后觀察拍照。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。利用HeLa△CTTN、Siha△CTTN細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲試驗(yàn)，利用胰蛋白酶將常規(guī)培養(yǎng)的各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液。將包被有8 μg/μl 基質(zhì)膠的transwell濾器置于24孔培養(yǎng)板孔中,下室加含有20%牛血清抗原的培養(yǎng)液，上室加細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)36 h后，取出transwell濾器，用棉簽拭去其濾膜上未遷移細(xì)胞，固定染色。利用顯微鏡觀察及任選5個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組保留CTTN基因，干擾CTTN組敲除CTTN基因，即HeLa△CTTN及Siha△CTTN。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Mann-Whitney U-檢驗(yàn)分析增殖、遷移和侵襲能力在各組細(xì)胞之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白在各組織中表達(dá) 皮層肌動(dòng)蛋白、磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr421)和磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr466)主要表達(dá)于細(xì)胞膜及胞漿。皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)在正常宮頸組織、宮頸不典型增生及鱗狀上皮細(xì)胞癌組織之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常宮頸及輕度不典型增生組織比較，磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr421)和磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr466)的表達(dá)在中度、重度不典型增生及鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)影響因素分析 宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中，皮層肌動(dòng)蛋白的表達(dá)與年齡、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr421)和磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr466)表達(dá)的影響因素(P<0.05)。見表2。

2.3 體外增殖、劃痕及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HeLa△CTTN及Siha△CTTN的細(xì)胞數(shù)顯著減弱，MKI67及PCNA mRNA的表達(dá)在HeLa△CTTN及Siha△CTTN中顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。提示皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白下調(diào)，可抑制宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)。劃痕、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常細(xì)胞比較，細(xì)胞的移動(dòng)性及侵襲性在HeLa△CTTN及Siha△CTTN中顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白下調(diào)，可抑制宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移性及侵襲性。見圖3、4。

表1 皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白在正常宮頸、不典型增生及宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中表達(dá)/例(百分率/%)

注：與正常宮頸比較，①P<0.05；與輕度宮頸不典型增生比較，②P<0.05

表2 宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)影響因素分析/例(百分率/%)

圖1 宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞增殖情況(a.HeLa細(xì)胞；b.Siha細(xì)胞)

圖2 宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞中MKi67、PCNA mRNA表達(dá)情況(a.HeLa細(xì)胞；b.Siha細(xì)胞)

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa△CTTN、Siha△CTTN及其對(duì)照組細(xì)胞遷移能力(a.HeLa細(xì)胞；b.Siha細(xì)胞)

3 討論

皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)與多種類型腫瘤的生物學(xué)功能密切相關(guān)。如在頭頸部腫瘤、直腸癌及胃癌等腫瘤中，皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及存活率降低等不良預(yù)后密切相關(guān)[8]。但筆者發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，不典型增生及宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)并未增加，而磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr421)和磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白(Tyr466)的表達(dá)卻在不典型增生及宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織中顯著增高。此外，皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)間也無明顯相關(guān)性。有研究表明，良性組織中存在皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)的缺失，皮層肌動(dòng)蛋白可在正常組織中表達(dá)[9]。也有研究表明，良性腫瘤組織中皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)顯著增加，而惡性腫瘤組織中皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)并未增加[10]。提示皮層肌動(dòng)蛋白的表達(dá)可能在不同的組織類型及器官，有著不同的生物學(xué)功能。

圖4 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HeLa△CTTN、Siha△CTTN及其對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力

皮層肌動(dòng)蛋白磷酸化與細(xì)胞移動(dòng)性及轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)[4]。有研究表明，Src介導(dǎo)的磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)對(duì)細(xì)胞移動(dòng)能力的影響比皮層肌動(dòng)蛋白過表達(dá)更重要，轉(zhuǎn)染突變型皮層肌動(dòng)蛋白后，對(duì)細(xì)胞移動(dòng)能力沒有明顯影響，但阻斷皮層肌動(dòng)蛋白的酪氨酸磷酸化后，細(xì)胞移動(dòng)能力顯著降低[11-13]。本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，篩選兩種高表達(dá)皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株，并觀察到正常細(xì)胞在干擾皮層肌動(dòng)蛋白后，皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白同時(shí)下調(diào)，且其生物學(xué)行為有顯著變化。但皮層肌動(dòng)蛋白在正常、不典型增生及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)無明顯差異，且其表達(dá)與宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌患者的臨床病理學(xué)指標(biāo)間也無顯著相關(guān)性，筆者推測(cè)皮層肌動(dòng)蛋白在被磷酸化前，對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌可能無重要作用。筆者發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中，皮層肌動(dòng)蛋白磷酸化與T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)果提示，磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白表達(dá)在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不明確。作為F-肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，皮層肌動(dòng)蛋白在體外將F-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。酪氨酸磷酸化可抑制CTTN蛋白交聯(lián)F-肌動(dòng)蛋白的能力，但其是否會(huì)影響CTTN蛋白交聯(lián)肌動(dòng)蛋白的能力仍存在爭(zhēng)議[14-15]。有關(guān)磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，皮層肌動(dòng)蛋白及磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白的下調(diào)，可顯著降低宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。磷酸化皮層肌動(dòng)蛋白與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。