谷氨酸—木糖美拉德中間體的水相制備及其在桃酥中的應用

徐 慢 孫福犁 崔和平 于靜洋 張曉鳴

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

美拉德反應是羰基和氨基化合物脫水縮合最終形成褐色聚合物類黑精[1]的一種非酶促褐變反應，產(chǎn)生的醛、酮、吡嗪、呋喃等揮發(fā)性物質(zhì)賦予食物令人愉悅的香氣，在香精工業(yè)中得到廣泛的應用[2]。完全美拉德反應香精風味濃郁，但香氣損失快[3]；而美拉德反應中間體(Maillard reaction intermediate，MRI)作為風味化合物前體，具有穩(wěn)定的化學性質(zhì)，本身無香味也不會褐變，但可通過后續(xù)熱加工過程繼續(xù)發(fā)生美拉德反應而產(chǎn)生風味[4]，這使得MRI具有代替完全美拉德香精應用于食品中的潛力。

對于無羥基保護的MRI的合成，目前集中在以甲醇作為溶劑的研究中[5-6]，該方法操作簡單、轉(zhuǎn)化率高，但因成本較高不適合工業(yè)化生產(chǎn)而僅適用于實驗室研究，還會帶來環(huán)境問題[7]。以水作為溶劑可緩解環(huán)境問題，但水相中的美拉德反應是一系列的多級聯(lián)反應，會產(chǎn)生多種副產(chǎn)物而導致MRI產(chǎn)量較低。而谷氨酸的兩個羧基抑制其美拉德反應的活性，降低了反應速率及MRI產(chǎn)量，限制了谷氨酸作為美拉德反應原料的應用[8]。

Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)當谷氨酸的比例較高時，美拉德反應產(chǎn)物可產(chǎn)生較強的烘烤和堅果香，為谷氨酸美拉德反應在烘焙食品中的增香提供了新思路。以谷氨酸為原料的美拉德反應主要用于改善肉的風味和鮮味[10-11]，而缺乏應用于烘焙食品的研究。桃酥作為一種中式糕點，口感酥脆、味道香甜、做法簡便，廣受消費者喜愛[12]，且僅由面粉、糖、油組成，體系相對簡單，因此，選擇桃酥體系研究MRI對烘焙食品的增香作用。

本研究擬以谷氨酸和木糖為原料，優(yōu)化水相中制備MRI的工藝條件，通過熱反應與真空脫水耦聯(lián)的方法提高谷氨酸MRI的轉(zhuǎn)化率；并將其應用于桃酥體系，通過GC/MS及感官評定等方法研究其對桃酥風味的影響，為谷氨酸MRI在烘焙食品中的應用及開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

D-木糖、L-谷氨酸：食品級，上海源葉生物科技有限公司；

L-半胱氨酸、氫氧化鈉、甲酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙腈：HPLC級，國藥集團化學試劑有限公司；

1,2-二氯苯：標準品，國藥集團化學試劑有限公司；

谷氨酸—木糖MRI純品：純度為98.33%，實驗室自制；

正構(gòu)烷烴C6～C26：標準品，美國Sigma公司；

低筋面粉、色拉油、雞蛋、白砂糖、小蘇打、泡打粉：市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計：UV-1800型，島津-GL(上海)有限公司；

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：MALDI SYNAPT MS型，美國沃特世公司；

全數(shù)字化核磁共振波譜儀：Aduance Ⅲ 400MHZ型，德國布魯克AXS有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BUCHI R-210型，上海島通應用科技有限公司；

凍干機：SCIENTZ-18N型，寧波新芝生物科技有限公司；

三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：TSQ Quantum XLS型，美國賽默飛世爾科技公司；

1.2 方法

1.2.1 MRI水相制備 木糖和谷氨酸以2∶1的摩爾比溶于去離子水(總濃度為0.026 g/mL)，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7后轉(zhuǎn)移到美拉德反應瓶中，在90 ℃加熱10～180 min 后冷卻，得到谷氨酸—木糖MRI溶液。

1.2.2 MRI的表征和檢測 將1.2.1得到的MRI溶液使用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-ESI-MS)進行檢測。色譜條件：色譜柱CSH C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸；梯度洗脫程序為20 min內(nèi)流動相2～100%線性梯度；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓3.5 kV；錐孔電壓20 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑溫度400 ℃；氣流量700 L/h；錐孔氣體流速50 L/h；碰撞能量為6 V；掃描范圍m/z20～1 000，掃描時間1 s，掃描延遲0.1 s；探測器電壓1 800 V。

MRI溶液通過半制備高效液相色譜進行純化，色譜條件：Xbrige?BEH Amide (4.6 mm×250 mm，5 mm)色譜柱；流動相為乙腈-0.1%甲酸/超純水-0.1%甲酸梯度洗脫；流速1 mL/min；進樣量200 μL。純化后的樣品通過凍干后得到固體純品，通過上述UPLC-ESI-MS及NMR進行定性分析。將純化的后的MRI(純度為98.33%)作為標準品用于后續(xù)樣品的定量，通過計算不同濃度標準品的峰面積得到標準曲線：y=6.265 6x-1.052 2，R2=0.997 5。

1.2.3 MRI轉(zhuǎn)化率隨時間變化曲線的測定 將木糖和谷氨酸以2∶1的摩爾比溶于去離子水，調(diào)節(jié)pH至7，在90 ℃ 下加熱10～190 min，每隔10 min取樣，用UPLC-ESI-MS測定MRI峰面積，根據(jù)1.2.2中的標曲計算MRI濃度，通過MRI摩爾濃度與初始谷氨酸濃度百分比來計算MRI的轉(zhuǎn)化率，以轉(zhuǎn)化率為縱坐標，反應時間為橫坐標作圖，即可得到MRI轉(zhuǎn)化率隨時間變化的曲線。

1.2.4 反應物配比對MRI生成的影響 將木糖和谷氨酸以不同摩爾比(2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2)溶于去離子水，調(diào)節(jié)溶液pH至7，分別于90 ℃反應140 min，冷卻后測定MRI轉(zhuǎn)化率，研究反應物配比對MRI轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.5 溶液初始pH對MRI生成的影響 將木糖和谷氨酸以2∶1的摩爾比溶于100 mL去離子水后，將溶液pH分別調(diào)節(jié)為5，6，7，8，9，于90 ℃下反應140 min后立即冷卻，測定MRI的轉(zhuǎn)化率，研究溶液初始pH對MRI生成的影響。

1.2.6 真空脫水對MRI轉(zhuǎn)化率的影響 根據(jù)MRI生成的臨界條件，將木糖和谷氨酸以2∶1的摩爾比溶于去離子水，pH調(diào)至7，90 ℃下反應140 min后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在85 ℃下分別脫水5，10，15，20 min，測定MRI轉(zhuǎn)化率，研究脫水過程對MRI轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.7 桃酥的制備 按上述條件得到MRI轉(zhuǎn)化率最高的條件制備谷氨酸—木糖MRI樣品，經(jīng)冷凍干燥后得到粉末，按0.1%，0.3%，0.5%，0.7%(相對于面粉質(zhì)量)的添加量添加到桃酥體系中，以未添加的體系作空白對照，研究不同MRI添加量對桃酥風味的影響。桃酥的制作參考汪曉琳等[12]的方法并將配方稍作修改：低筋面粉210 g，色拉油90 g，白砂糖70 g，雞蛋液30 g，泡打粉2 g，小蘇打1 g，添加MRI粉末的樣品相應減少面粉的量。制作方法：原料混合，揉成面團，塑型，烤箱中200 ℃烤制15 min。

1.2.8 風味分析 使用頂空—固相微萃取(HS-SPME)—氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)分析揮發(fā)性風味物質(zhì)。HS-SPME條件：樣品粉碎后稱取2.0 g于20 mL 頂空瓶中，加入飽和NaCl溶液3 mL及0.015 μg/μL 的1,2-二氯苯內(nèi)標10 μL后立即密封。樣品在50 ℃ 水浴平衡5 min后插入已老化的萃取頭(75 μm；CAR/PDMS)于頂空瓶中距離樣品上方1 cm左右處，萃取30 min后進樣，進樣口250 ℃，解吸7 min。GC/MS：采用DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，參考Pasqualone等[13]報道的檢測曲奇餅干香氣成分的方法。

1.2.9 感官分析 感官評定小組由20名經(jīng)驗豐富的感官評定員(20～50歲，8男12女)組成，感官評分標準見表1。

表1 桃酥感官評分標準Table 1 The sensory evaluation standards of walnut cookie

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 19.0進行顯著性差異分析，數(shù)據(jù)存在顯著性差異時P<0.05。GC/MS數(shù)據(jù)由Xcalibur軟件處理，未知物質(zhì)經(jīng)計算機檢索后與NIST譜庫和Wiley譜庫進行匹配。使用軟件Excel 2016制表和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫反應過程MRI轉(zhuǎn)化率隨時間變化曲線

通過測定MRI的濃度，研究在90 ℃加熱谷氨酸—木糖溶液不同時間后MRI轉(zhuǎn)化率的變化情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 低溫反應時間對MRI轉(zhuǎn)化率的影響Figure 1 Effect of low temperature reaction time on the conversion of MRI

從圖1可以看出：谷氨酸—木糖MRI的轉(zhuǎn)化率隨著低溫反應時間的延長逐漸增加，在140 min時達到最大(1.85%)，之后基本保持不變。由于隨著加熱時間的增加，MRI逐漸產(chǎn)生，同時也繼續(xù)進行美拉德反應而被消耗掉，在140 min后MRI生成速率和消耗速率基本持平而達到動態(tài)平衡狀態(tài)，因此MRI的轉(zhuǎn)化率基本不變。

2.2 反應物配比對MRI轉(zhuǎn)化率的影響

改變木糖—谷氨酸的配比(2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2)后，MRI轉(zhuǎn)化率的變化如圖2所示。結(jié)果表明，木糖與谷氨酸的配比為2∶1時，MRI的轉(zhuǎn)化率最大，作為反應底物，木糖的含量增多促進了谷氨酸的反應從而導致MRI轉(zhuǎn)化率的提高。當谷氨酸的量多于木糖的量時，其MRI的轉(zhuǎn)化率反而低于等摩爾比時的轉(zhuǎn)化率，源于MRI轉(zhuǎn)化率是按MRI與初始谷氨酸的摩爾比計算，即使谷氨酸增加會促進MRI的形成使其濃度增大，但按摩爾氨基轉(zhuǎn)化率計算卻不會使得MRI轉(zhuǎn)化率增大。繼續(xù)增加木糖的量可促進MRI形成，但對轉(zhuǎn)化率并不會有較大提高，而剩余的木糖反而會造成浪費，增加成本，故選取木糖與谷氨酸的摩爾比為2∶1。

圖2 反應物配比對MRI轉(zhuǎn)化率的影響Figure 2 The effect of reactant ratio on the conversion of MRI

2.3 反應初始pH對MRI轉(zhuǎn)化率的影響

圖1中，谷氨酸—木糖MRI在加熱到140 min時轉(zhuǎn)化率達最大，但轉(zhuǎn)化率僅為1.85%，由于在水相中美拉德反應是一個復雜的多級反應，還原糖和氨基酸脫水縮合生成席夫堿，再由席夫堿重排生成MRI，而MRI生成后隨參與后續(xù)反應而消耗掉。據(jù)Ge等[14]的報道，MRI的形成遵循一級動力學方程且所需的活化能較大，而席夫堿的生成遵循二級動力學方程，MRI的生成不僅受反應底物濃度的限制，還受席夫堿的限制。同時，反應液初始pH也會影響MRI的轉(zhuǎn)化率，改變不同初始pH，得到MRI轉(zhuǎn)化率的變化如圖3所示。MRI的轉(zhuǎn)化率隨著pH的升高而逐漸升高，pH為9時，轉(zhuǎn)化率為2.2%，MRI轉(zhuǎn)化率的提高不明顯。Ge等[14]研究pH對Amadori化合物的轉(zhuǎn)化率的影響也發(fā)現(xiàn)，當體系pH在2～10時，MRI的轉(zhuǎn)化率隨著pH的升高而逐漸提高，但當pH升至12時MRI的轉(zhuǎn)化率大幅升高，這主要是因為形成席夫堿反應的親核性。參與美拉德反應的是氨基而不是胺離子，堿性條件(pH >7)下，胺離子的質(zhì)子被釋放，增加了參與席夫堿形成反應的氨基酸的有效濃度。體系pH增加有利于席夫堿的形成，從而促進席夫堿向MRI轉(zhuǎn)化。隨著美拉德反應的進行，體系的pH值隨之下降[15]，故僅調(diào)節(jié)體系的初始pH并不能對MRI的生成起到持續(xù)性的影響，從而導致調(diào)整初始pH并不能大幅度提高轉(zhuǎn)化率，應嘗試其他方法來提高MRI的轉(zhuǎn)化率。

圖3 初始pH對MRI轉(zhuǎn)化率的影響Figure 3 Effect of initial pH on the conversion of MRI

2.4 真空脫水過程對MRI轉(zhuǎn)化率的影響

由上述研究可知，反應時間、pH和反應物配比均會影響MRI的轉(zhuǎn)化率，改變這些條件并不會對谷氨酸—木糖MRI的轉(zhuǎn)化率有很大的提升。Cui等[16]報道過在水相中脫水過程可促進MRI的形成。因此，擬通過在常壓水相反應后添加真空脫水過程提高MRI的轉(zhuǎn)化率。在圖1中，MRI在加熱140 min后轉(zhuǎn)化率達最高并隨后趨于平穩(wěn)，考慮在脫水的前期體系中水分含量變化不大，因而選擇在MRI達到最大之前加入脫水過程，從而研究真空脫水過程對MRI轉(zhuǎn)化率的影響。將谷氨酸—木糖溶液在90 ℃下反應130 min后，于85 ℃下研究脫水時間對MRI轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 脫水時間對MRI轉(zhuǎn)化率的影響Figure 4 Effect of dehydration time on the conversion of MRI

結(jié)果表明，在真空脫水過程中，MRI轉(zhuǎn)化率隨著脫水時間的延長呈先升高再降低的趨勢。據(jù)Beksan等[8]的研究，N-糖氨脫水生成席夫堿的反應為動態(tài)平衡。在真空脫水過程中，水被逐漸除去，導致化學平衡右移，席夫堿的大量生成促進其Amadori重排生成MRI并逐漸累積。同時，MRI繼續(xù)進行美拉德反應而被消耗掉。在脫水的早期(0～15 min)，MRI的累積量大于其消耗量，轉(zhuǎn)化率升高；在脫水反應的后期(15～20 min)，MRI的消耗量大于累積量，轉(zhuǎn)化率逐漸下降。故85 ℃下最優(yōu)的脫水時間為15 min，此條件下的轉(zhuǎn)化率為75.11%。與不添加脫水過程而直接反應140 min后的轉(zhuǎn)化率(1.85%)相比，脫水后MRI的轉(zhuǎn)化率提高了39.6倍。

2.5 MRI添加量對桃酥揮發(fā)性風味物質(zhì)形成的影響

利用常壓熱反應和真空脫水耦聯(lián)得到MRI轉(zhuǎn)化率最高的樣品，以不同的比例(0.1%，0.3%，0.5%，0.7%)添加到桃酥體系中，與未添加MRI的樣品對比，采用GC/MS研究MRI添加量對揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響，結(jié)果如表2、3所示。

空白和MRI添加量為0.1%，0.3%，0.5%，0.7%的桃酥樣品中檢測到的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類分別為：20，28，29，27，27種(見表3)。由此可見，添加MRI后桃酥中揮發(fā)性風味物質(zhì)種類有所增加，而添加MRI的量不同時風味物質(zhì)的種類差別不大。

醇類物質(zhì)閾值較高，對風味的貢獻不突出。醛類物質(zhì)閾值較低，添加MRI的桃酥與空白樣品相比醛類物質(zhì)總量差別不大。添加MRI的桃酥中苯甲醛的含量增大，可能是MRI中的木糖、二羰基化合物等與雞蛋里的苯丙氨酸發(fā)生美拉德反應或Strecker降解反應，導致桃酥中苯甲醛的含量增大。苯甲醛具有苦杏仁味，含量過高時可能會影響桃酥的整體風味，故MRI添加過多時可能會影響桃酥整體風味。

酮類物質(zhì)閾值較低，對風味的貢獻較大，空白樣品中未檢出，僅在添加0.1%及0.3% MRI的桃酥中檢出，其中含量較高的為2,3-戊二酮，具有奶香味，可能是添加的MRI經(jīng)過美拉德反應生成的一種二羰基化合物；而MRI添加量較高時也未檢出，可能是濃度提高后美拉德反應加劇，從而使二羰基化合物繼續(xù)與氨基酸發(fā)生Strecker降解反應生成吡嗪而消耗掉。MRI添加量升高后，吡嗪類物質(zhì)也隨之升高的現(xiàn)象也驗證了這一推測。

雜環(huán)類化合物如呋喃、吡嗪、吡咯等物質(zhì)主要由氨基酸與還原糖之間的美拉德反應、氨基酸降解產(chǎn)生。其中，呋喃類化合物主要是通過MRI脫氨基形成脫氧糖酮后再脫水形成的，常見于烘焙食品中，為其提供了甜香、水果香、堅果香和焦香[17]。與空白相比，添加MRI的桃酥中呋喃類物質(zhì)的總含量相對較高，這主要是由于額外添加的MRI受熱可進一步反應生成呋喃類物質(zhì)，使得添加MRI的桃酥中呋喃類物質(zhì)含量較高。

吡嗪類具有較低閾值，具有堅果、焙烤等香氣[18]，可顯著增加面包、蛋糕、餅干等烘焙食品的香氣[19]，主要由美拉德反應中生成的二羰基化合物與氨基酸發(fā)生Strecker降解產(chǎn)生。添加MRI的桃酥中檢測到吡嗪的種類和數(shù)量都高于空白樣品，說明MRI為桃酥增添了更豐富的焙烤香氣；且隨著MRI添加量增加，桃酥中吡嗪含量也升高。MRI熱反應產(chǎn)生的二羰基化合物可與谷氨酸以及桃酥體系中其他游離氨基酸發(fā)生Strecker降解，使得吡嗪類物質(zhì)種類增加；而添加MRI樣品中還有未反應的木糖和谷氨酸等物質(zhì)，還可在受熱時繼續(xù)發(fā)生美拉德反應而產(chǎn)生更多的揮發(fā)性風味物質(zhì)，進一步說明MRI的添加可提高桃酥的焙烤香氣。

表2 添加0.0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7% MRI的桃酥中的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)?Table 2 The major volatile compounds in walnut cookie with the MRI additionof 0.0%，0.1%，0.3%，0.5% and 0.7%

? ND表示未檢出。

表3 添加0.0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%MRI的桃酥中的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)匯總Table 3 Summary of major volatile flavor compounds in walnut cookie with the MRI addition of 0.0%，0.1%，0.3%，0.5% and 0.7%

吡咯類物質(zhì)通常被描述為焦糖香，有類似爆米花的香氣[20]，主要是通過美拉德反應或焦糖化反應產(chǎn)生。添加MRI的桃酥中均檢測到3種吡咯類物質(zhì)，而空白樣品中未檢出。

綜上分析，通過對比添加MRI的桃酥和空白組樣品，可發(fā)現(xiàn)谷氨酸—木糖MRI的添加并不會帶來額外的異味，添加MRI的桃酥風味明顯優(yōu)于未添加的；MRI添加量較低時對風味提升效果不明顯，而MRI添加量過高時可能會產(chǎn)生異味物質(zhì)而影響桃酥整體風味。

2.6 感官分析

由表4的感官評定結(jié)果可知：對于各項感官指標，MRI的添加均會對桃酥的色澤、氣味、口感、滋味產(chǎn)生影響。不同樣品的形態(tài)評分之間無明顯差別，說明MRI的添加對桃酥的形態(tài)無顯著影響。桃酥的色澤評分隨著MRI的添加呈先升高再降低的趨勢，說明添加的MRI發(fā)生美拉德反應有利于桃酥形成良好的色澤，但添加量過多會使美拉德反應加劇、褐變加深而影響桃酥色澤評分。桃酥的氣味感官分數(shù)也隨著添加量增大而增大且顯著高于未添加的樣品，與GC/MS檢測的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的結(jié)果一致，說明MRI的添加可提升桃酥香氣。對于桃酥的口感和滋味指標，感官評定的結(jié)果均是添加MRI的樣品顯著高于未添加的樣品，但添加不同量的樣品之間差別不顯著。添加MRI影響桃酥的口感可能是添加的MRI在美拉德反應高級階段產(chǎn)生二氧化碳等氣體，使得桃酥的口感更酥脆。添加MRI的桃酥其感官評定總評分均高于空白樣品，說明MRI的添加可提高桃酥的整體感官品質(zhì)，且添加量為0.3%時綜合感官評分最高。

表4 不同MRI添加量的桃酥感官評價綜合評分?Table 4 Comprehensive scores of sensory evaluation for different MRI addition in walnut cookie

? 不同字母表示差異顯著性(P <0.05)。

3 結(jié)論

利用谷氨酸—木糖水相美拉德反應制備MRI，通過優(yōu)化反應物配比、初始反應pH及真空脫水方法提高水相中MRI轉(zhuǎn)化率，將轉(zhuǎn)化率從1.85%提高到75.11%。為研究MRI在實際烘焙食品中的增香效果，將不同量的MRI添加到桃酥中，通過GC/MS及感官評定的方法分析MRI對實際體系風味的影響。GC/MS結(jié)果表明MRI添加會增加揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類和數(shù)量，且風味物質(zhì)數(shù)量隨添加量增大而增大。結(jié)合感官評定結(jié)果分析，MRI添加量為0.3%時，對桃酥色澤和風味有較好貢獻。上述研究結(jié)果可為以谷氨酸為原料制備MRI及其在烘焙食品中的應用提供一定參考。