葡萄砧木雜種的耐堿性鑒定

張星，張劍俠*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

土壤鹽堿化是影響世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最主要的非生物脅迫之一，已成為限制農(nóng)作物生長的一個主要因素[1]。我國是鹽堿地大國，土地鹽堿化總面積約為3630萬 hm2，并有持續(xù)擴大的趨勢[2]。我國鹽堿地大部分分布在北方干旱、半干旱和半濕潤地區(qū)，鹽堿脅迫會降低土壤滲透勢、導(dǎo)致離子失衡，進而抑制植物生長，降低作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴重地區(qū)甚至?xí)?dǎo)致植物死亡，鹽堿脅迫已經(jīng)成為制約果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[3]。

葡萄屬于非鹽生植物，但相比其它北方落葉果樹而言，其耐鹽堿極限較大且耐鹽堿能力依品種、砧木、樹齡、生長期的不同而不同[4]。隨著我國葡萄種植范圍的擴大以及區(qū)域化栽培的需要，在利用嫁接栽培時，對砧木和接穗品種進行試驗[5]，篩選出具有不同抗性且與接穗親和性良好的砧木品種，是我國葡萄生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要[6]。

本試驗以課題組自主選育的4個葡萄砧木組合的雜種優(yōu)株作為試驗材料，采用澆灌濃度為0.5 mol/L NaHCO3與Na2CO3（1∶1）的混合鹽溶液（pH8.5）來模擬堿脅迫環(huán)境，觀察記錄不同株系的黃化程度并進行堿害嚴重度分級，同時測定葉片的相關(guān)生理指標并利用隸屬函數(shù)法進行評價，以堿害嚴重度作為主指標，參考3項生理指標的平均隸屬函數(shù)值，對不同材料進行耐堿性評價，以篩選出耐堿性強的雜種優(yōu)株，為選育多抗性砧木新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃中保存的4個砧木雜交組合的32個雜種優(yōu)株。具體組合為：河岸葡萄（♀）（V. riparia）×山葡萄左山75097（V.amurensis）12個優(yōu)株；山葡萄泰山-11（V. amurensis）×河岸-2（V. riparia Mcadams）3個優(yōu)株；山葡萄泰山-11（V. amurensis）×沙地葡萄（V. rupestris）3個優(yōu)株；5BB（V. berlandieri×V. riparia）×山葡萄黑龍江實生（V. amurensis）14個優(yōu)株。以砧木品種‘5BB’作為耐堿對照（CK1），歐洲葡萄品種‘紅地球’作為不耐堿對照（CK2）。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準備

2018年6月初對試驗材料進行盆中壓條繁殖。營養(yǎng)土配置按照園土∶蛭石∶有機肥=5∶1∶0.5的比例，混合均勻后裝入內(nèi)徑33 cm的花盆中，每盆裝營養(yǎng)土10 kg。將裝有營養(yǎng)土的花盆搬至試驗樹下，先將花盆中的土倒出一半，選擇母樹上生長較長的一年生綠枝，摘去剛好沒入花盆中部位所生長的葉片，用小刀在韌皮部輕輕劃兩下，然后埋入土中，覆土并澆灌0.1 mg/L的IBA溶液，以促進生根，最后將另一半土覆上，之后定時澆水、除草、松表土，每雜種（品種）壓條繁殖4盆。8月中旬剪離母株，9月中旬每雜種（品種）各選擇生長健壯的2株盆栽苗搬入大棚中進行堿脅迫試驗。

1.2.2 試驗處理

2018年9月上旬預(yù)備試驗，參照ZHANG等[7]對蘋果砧木水培堿脅迫用摩爾比為1∶1的濃度為1 mol/L的Na2CO3與NaHCO3混合液的方法，對上一年葡萄砧木雜種及對照品種‘5BB’‘紅地球’的盆栽植株共56份材料在大棚中進行堿脅迫處理。結(jié)果顯示，該濃度下3 d后約1/4的盆栽植株死亡，表明該濃度偏高，不適合于葡萄耐堿性評價。

9月中旬對當(dāng)年壓條繁殖的32個雜種優(yōu)株盆栽苗，采用摩爾比為1∶1的濃度為0.5 mol/L的Na2CO3與NaHCO3混合液（pH8.5）進行澆灌，模擬堿脅迫處理，每盆澆灌混合液800 mL，每5 d澆灌一次，共澆灌兩次。每個試驗材料處理設(shè)置1個處理組，1個對照組，對照為清水澆灌。進行為期10 d的堿脅迫，并在處理當(dāng)天、5 d、10 d后記錄堿害嚴重度并測定相應(yīng)生理指標。

1.2.3 指標測定

電導(dǎo)率的測定采用電導(dǎo)儀法[8]；葉綠素的測定采用直接浸提法[9]；丙二醛測定采用硫代巴比妥酸法[10]。

根據(jù)堿害分級標準[11-12]進行堿害分級，堿害分級標準為：

0級—生長正常，無堿害癥狀；

1級—輕度堿害，有少部分葉片出現(xiàn)失綠斑；

2級—中度堿害，大部分葉片出現(xiàn)失綠斑；

3級—重度堿害，大部分葉片黃化；

4級—極重度堿害，葉片黃化發(fā)白、葉落。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用隸屬函數(shù)法進行耐堿性綜合評價[13]，其公式為：

式中：Uij表示i種類j指標的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類j指標的測定值；Xjmin表示所有種類j指標的最小值；Xjmax表示所有種類j指標的最大值；i表示某個品種；j表示某項指標。

根據(jù)公式計算出隸屬函數(shù)值，再用每株系的生理指標隸屬函數(shù)值的平均數(shù)作為其平均隸屬度。按照平均隸屬度（Subordinate level，SL）將耐堿性分為5級：0.70～1.00為高耐堿（HR），1級；0.50～0.69為耐堿（R），2級；0.40～0.49為中等耐堿（MR），3級；0.30～0.39為不耐堿（S），4級；0～0.29為極不耐堿（HS），5級。

生理指標采用SPSS 25.0軟件分析，采用Duncan's法進行平均數(shù)多重比較。

1.2.5 耐堿性分級

以堿害嚴重度作為主指標，參考3項生理指標的平均隸屬函數(shù)值，將葡萄的耐堿性分為5個類型：高耐堿類型、耐堿類型、中等耐堿類型、不耐堿類型、極不耐堿類型。

2 結(jié)果與分析

不同的堿害等級，從表觀水平上反映了各株系不同的耐堿水平。由表1可知，根據(jù)脅迫10 d堿害程度分級，‘HS-2’‘HS-5’‘HS-6’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘TH-3’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-15’‘5BB’僅表現(xiàn)為輕微受堿脅迫癥狀，堿害等級為1級；‘HS-1’‘HS-3’‘TH-1’‘BBS-13’‘紅地球’大部分葉片出現(xiàn)失綠斑，堿害等級為2級；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘TS-3’‘BBS-2’‘BBS-3’‘BBS-11’大部分葉片出現(xiàn)黃化，堿害等級為3級；‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-12’受到極重度堿害，葉片黃化脫落甚至死亡，堿害等級達到4級。

表1 各砧木雜種優(yōu)株堿害程度分級Table 1 The class of alkali injury of different grape rootstock hybrids

由表2可知，不同砧木雜交后代的葉綠素含量在堿脅迫下變化趨勢不同，葉綠素含量的變化趨勢分為3種，‘HS-1’‘HS-5’‘HS-11’‘BBS-1’‘5BB’‘紅地球’的葉綠素含量先增加后減少，‘HS-6’‘HS-7’‘HS-12’‘TH-1’‘TH-2’‘BBS-4’‘BBS-10’‘BBS-13’的葉綠素含量先減少后增加，其余株系葉綠素含量一直減少，‘HS-7’‘HS-12’‘TH-3’‘BBS-5’‘5BB’的葉綠素在10 d的含量大于脅迫初期，且‘5 B B’含量增加最大，增幅達到21%。葉綠素含量下降幅度最大的是‘HS-3’，降幅達到69.6%，其余株系下降幅度在4%～69.1%，表明不同葡萄砧木雜種優(yōu)株對堿脅迫的響應(yīng)方式不同。表中，部分株系如‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-2’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-11’‘BBS-12’在試驗結(jié)束之前便已葉落干枯，無法測定其葉綠素含量，也從側(cè)面反映其耐堿性較差。

由表3可知，脅迫10 d與脅迫初期相比，4個組合葉綠素含量均出現(xiàn)顯著性下降。其中，TS組合下降比例最高，為46.1%；TH組合下降比例最低，為17.4%；BBS與HS組合下降比例分別為33.3%與23.8%。脅迫10 d與5 d相比，TH組合葉綠素含量顯著性下降27.2%，其余各組合葉綠素含量無顯著變化。

表2 各砧木雜種優(yōu)株葉綠素（Chl）含量變化Table 2 Changes of chlorophyll content of different grape rootstock hybrids under alkali stress (Unit: mg/g FW)

表3 各雜交組合葉綠素含量變化顯著性分析Table 3 Signi fi cant analysis of chlorophyll content of different cross combinations

由表4可知，各個株系的葉片相對電導(dǎo)率值變化趨勢基本相同，除極個別株系如‘HS-1’先升后降，‘BBS-4’先降后升之外，其余株系均隨著脅迫時間的延長而增加，且增加幅度因植株耐堿性的強弱而表現(xiàn)出較大差異。在堿脅迫10 d時，相對電導(dǎo)率值最小的是‘HS-11’，為30.0%；最大的是‘BBS-1’，為63%。其余株系電導(dǎo)率在32%～59%。與脅迫初期相比，‘HS-3’與‘HS-6’的相對電導(dǎo)率增加值最大，分別增加了3.76倍與3.19倍，其它株系如‘HS-2’‘HS-5’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-12’‘TS-3’的電導(dǎo)率增加值也均在100%以上，增加值最小的是‘紅地球’和‘BBS-15’，分別只增加了15%和16%。脅迫末期部分株系因耐堿性差，達到極重度堿害而無法采樣對電導(dǎo)率值進行測定，其中，‘BBS-7’‘BBS-8’在5 d時電導(dǎo)率值已經(jīng)達到90%以上，說明其極不耐堿。

由表5分析可知，脅迫10 d與脅迫初期相比，各組合相對電導(dǎo)率值都出現(xiàn)顯著性上升，其中HS組合上升125%，上升比例最高，BBS組合上升23.2%，上升比例最低，TH和TS組合分別上升了38.5%和40.4%。脅迫10 d與5 d相比，HS、TH與BBS組合相對電導(dǎo)率值分別顯著性上升30.3%、14.9%、17.8%，TS組合變化不顯著。

植物在逆境條件下通常會發(fā)生活性氧的積累，發(fā)生膜脂化作用，丙二醛（MDA）便是其主要產(chǎn)物之一，通常將其作為膜脂過氧化程度的指標，表示植物對逆境條件反應(yīng)的強弱。由表6可知，堿脅迫條件下不同株系MDA含量隨時間的延長均不斷增加，MDA增加幅度因株系間自身差異而有較大區(qū)別，堿脅迫10 d時，MDA含量最高的是‘TS-3’，達到11.35 mmol/g；MDA含量最低的是‘HS-12’，為8.21 mmol/g。與脅迫初期相比，MDA增量最大的是‘HS-4’，增加了8.82 mmol/g；增量最小的是‘BBS-5’，為2.36 mmol/g。其余株系的MDA增量介于2.70～7.27 mmol/g，MDA增量的不同，反映了各株系在堿脅迫下受到的傷害不同。

表4 各砧木雜種優(yōu)株相對電導(dǎo)率（REC）變化Table 4 Changes of relative electrical conductivity of different grape rootstock hybrids under alkali stress

表5 各雜交組合電導(dǎo)率變化顯著性分析Table 5 Signi fi cant analysis of REC of different cross combinations

由表7分析可知，脅迫10 d與脅迫初期相比，各組合MDA含量均出現(xiàn)顯著性上升，其中HS組合上升194%，上升比例最高；TH組合上升50.3%，上升比例最低；TS和BBS組合分別上升115%和71.8%。脅迫10 d和5 d相比，HS、TS與BBS組合MDA含量分別顯著性上升26.5%、48.0%、17.8%，TH組合變化不顯著。

由表8可以看出，通過隸屬函數(shù)法對堿脅迫10 d的各項指標進行綜合性評價后，各株系耐堿性分為高耐堿、耐堿、中等耐堿、不耐堿與極不耐堿5種類型，‘HS-5’‘5BB’(CK1)屬于高耐堿類型；‘HS-1’‘HS-2’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-13’‘BBS-15’屬于耐堿類型；‘HS-3’‘HS-6’‘TH-1’‘TH-3’‘紅地球’（CK2）屬于中等耐堿類型；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘BBS-3’屬于不耐堿類型；‘HS-10’‘TS-3’‘TS-6’‘BBS-2’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-11’‘BBS-12’屬于極不耐堿類型。

表6 各砧木雜種丙二醛（MDA）含量變化Table 6 Changes of MDA content of different grape rootstock hybrids under alkali stress (Unit: mmol/g FW)

表7 各雜交組合丙二醛（MDA）含量變化顯著性分析Table 7 Signi fi cant analysis of MDA content of different cross combinations

總體上，各供試材料表型與3項生理指標的平均隸屬函數(shù)值的評價結(jié)果相一致，有個別雜種2種方法評價結(jié)果略有差異。因此，以堿害嚴重度作為主指標，參考3項生理指標的平均隸屬函數(shù)值，將供試材料的耐堿性分為5種類型：‘HS-5’‘5BB’屬于高耐堿類型；‘HS-1’‘HS-2’‘HS-6’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘TH-3’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-15’屬于耐堿類型；‘HS-3’‘TH-1’‘BBS-13’‘紅地球’屬于中等耐堿類型；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘TS-3’‘BBS-2’‘BBS-3’‘BBS-11’屬于不耐堿類型；‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-12’屬于極不耐堿類型。

表8 脅迫10 d各砧木雜種優(yōu)株耐堿性平均隸屬值與耐堿水平Table 8 Subordinative level of alkali stress of different grape rootstock hybrids on 10 days

3 討論與結(jié)論

鹽堿脅迫會影響植物的生長和代謝等諸多方面，對光合作用的影響尤為突出[14]。鹽堿脅迫下，植物細胞中積累的Na+、Cl-使葉綠體類囊體膜糖脂和不飽和脂肪酸含量下降，飽和脂肪酸含量上升，導(dǎo)致膜的光合特性受到破壞，而葉綠素為類囊體膜上色素蛋白復(fù)合體的重要成分，這樣導(dǎo)致葉綠素含量降低，進而影響植物光合作用的積累[15]。晉學(xué)娟等[16]研究表明，不同鹽堿脅迫條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，紅地球/貝達嫁接苗葉片的葉綠素呈下降趨勢。付晴晴等[14]通過對各葡萄株系進行鹽堿脅迫，得出各葡萄株系葉片葉綠素含量以及凈光合速率（Pn）表現(xiàn)出不同程度的降低，且耐鹽性較好株系下降幅度明顯小于鹽敏感株系。本試驗中，有部分株系出現(xiàn)脅迫末期葉綠素含量大于脅迫初期的情況，這在前人的研究中也有類似結(jié)果[17]，說明不同葡萄砧木材料對堿脅迫不同的適應(yīng)過程以及在堿脅迫下不同的耐堿機制。

細胞膜是細胞體與外界發(fā)生物質(zhì)運輸和交換的重要通道，同時也是對環(huán)境脅迫最為敏感的部位。因此，植物細胞膜透性是研究植物抗性的一個重要生理指標[18]，當(dāng)植物受到逆境傷害時，膜脂首先受到傷害，造成細胞膜透性的變化[19]。鹽堿環(huán)境下，堿脅迫通過影響細胞膜的膜脂和膜蛋白，增大細胞膜脂的透性和提高膜脂過氧化的速度，進而使細胞膜的正常生理功能遭到破壞[20]。細胞膜受傷害之后內(nèi)含物外滲，可以根據(jù)外滲液電導(dǎo)率值的變化鑒定細胞膜的傷害程度[21]。膜透性可以直接反應(yīng)細胞膜受傷害的程度，MDA則間接反應(yīng)細胞膜受傷害的狀況[22]，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低可以表征膜脂的過氧化程度。郭淑華等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性鹽脅迫條件下，8個葡萄株系的電導(dǎo)率和MDA含量均升高且耐堿性越弱的株系增加量越高，說明敏感品種和株系在堿性鹽脅迫后細胞膜的完整性容易遭到破壞，膜脂過氧化作用明顯增加，植物細胞受損傷程度更為嚴重，這與本研究結(jié)果一致。

植物的耐鹽堿性是一個受多種因素控制的綜合性狀[23]，目前，主要通過中性鹽與堿性鹽模擬鹽堿脅迫環(huán)境對葡萄的耐鹽堿性進行研究。周萬海等[24]通過研究不同水平的NaCl處理濃度對6個葡萄砧木品種生長發(fā)育特性的影響，得出‘5BB’和‘520A’耐鹽性較強，‘SO4’和‘3309C’對鹽較敏感，‘貝達’‘圣喬治’耐鹽能力適中，這與本試驗中‘5BB’屬于高耐堿性結(jié)果一致；秦紅艷等[25]通過研究不同NaCl濃度處理對不同葡萄品種葉片中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，得出‘雙豐’和‘雙優(yōu)’葉綠素?zé)晒鈪?shù)受鹽害影響大于‘京優(yōu)’。在堿性鹽研究方面，王振興等[26]通過研究不同程度鹽堿脅迫對不同抗逆性山葡萄品種的光合作用、PSⅡ活性以及生長發(fā)育的影響，表明‘左山一’較‘雙優(yōu)’的耐堿性更強；杜遠鵬等[27]通過研究不同鹽堿類型脅迫對葡萄植株離子分布的影響，表明堿性鹽NaHCO3對植株影響最大。本試驗采用的是NaHCO3與Na2CO3的混合鹽溶液模擬堿脅迫環(huán)境對砧木雜種優(yōu)株進行處理，并篩選出耐堿性強的雜種優(yōu)株的方式。而在實際的栽培過程中，土壤結(jié)構(gòu)及鹽分組成都非常復(fù)雜，因此將結(jié)合田間實際情況對試材耐堿性作進一步研究。

在耐堿性評價中，葉片葉綠素含量，相對電導(dǎo)率值，MDA含量均為重要的測定指標，由于堿害嚴重度直接反應(yīng)植株的受傷害程度并從表觀上易于觀察，而生理指標的變化除了受到堿脅迫的影響之外還受到周圍試驗環(huán)境以及植株不同生長勢的影響，因此，本研究采用以堿害嚴重度作為主指標，將隸屬函數(shù)值作為參考指標，對試驗材料的耐堿性進行綜合性評價。本研究篩選出了高耐堿和耐堿雜種優(yōu)株15個，我們下一步的工作是對它們進行嫁接親和性試驗，結(jié)合前期的抗寒性、抗旱性、抗病性鑒定結(jié)果，最終選育出多抗性砧木新品種。