姜黃素對(duì)非酒精性脂肪性肝炎肝細(xì)胞凋亡的影響

李兵兵 陸其明 楊志宏 季 霞 闕揚(yáng)銘 周雪峰

姜科植物姜黃是一種天然調(diào)味品和食用色素原料，其主要成分之一姜黃素是一種酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用，且價(jià)格低廉、毒性低，已被各國(guó)學(xué)者廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究，雖然多項(xiàng)研究及我們的實(shí)驗(yàn)均表明姜黃素可延緩非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的發(fā)生發(fā)展，但其機(jī)制尚不十分明確。近年研究[1]表明，肝細(xì)胞凋亡在NASH的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用，且姜黃素對(duì)非腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用已被證實(shí)，并已用于多種相關(guān)疾病的研究，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于姜黃素對(duì)NASH的抗細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制的相關(guān)研究并不多。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察姜黃素對(duì)NASH模型肝細(xì)胞凋亡的影響，為該中藥用于防治NASH提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料 HL-7702細(xì)胞（杭州浩克生物技術(shù)有限公司），姜黃素（Sigma，78246-100MG），棕櫚酸（Sigma，P0500-10G），油酸（Sigma，O-1008-1G），活性氧檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，S0033），線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C2006-100T），1640 培養(yǎng)基（Biologi cal，10437028），胎牛血清（GIBICO，10437028），0.25%Trypsin（GIBICO，25200056），二甲基亞砜（Sigma，D2650）、Annexin V-FITC/PI Staining Solution、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Yeasen，40302ES50），熒光顯微鏡（Olympus，CKX41），離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺，TD5K-II），CO2培養(yǎng)箱（Thermo，311），自動(dòng)化酶免分析儀（北京天石醫(yī)療用品制作所，SM-3），流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝HL-7702細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)72h，細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，用不含EDTA的胰酶消化傳代，更換培養(yǎng)液。

1.2.2 藥物干預(yù)及分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞1×105/mL種植到96孔板孵育24h后，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、治療組（20μmol/L姜黃素）。對(duì)照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組、治療組均用內(nèi)含濃度為1.0mmol/L 的游離脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）的培養(yǎng)基培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行活性氧及線粒體膜電位檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化后，300g、4℃離心5min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞 2次，收集 1～5×105細(xì)胞。加入 100μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，取 5μL Annexin VFITC和5μL PI Staining Solution加入細(xì)胞懸液中混勻，避光，室溫反應(yīng) 10min，加入 400μL 1×Binding Buffer混勻后于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用CellQuest流式軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖。

1.2.4 線粒體相關(guān)檢測(cè) 分別用活性氧檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組ROS及膜電位的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組肝細(xì)胞凋亡率比較 Annexin V-FITC標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞，PI標(biāo)記中晚期凋亡細(xì)胞。Annexin V-FITC為橫坐標(biāo)，代表綠色熒光強(qiáng)度；PI為縱坐標(biāo)，代表紅色熒光強(qiáng)度。三組間早期凋亡率及總凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，0.00），而中晚期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.13）；模型組與對(duì)照組比較，早期凋亡率及總凋亡率均明顯增高（P＜0.05），而治療組與模型組比較，早期凋亡率及總凋亡率均明顯降低（P＜0.05），見表1、插頁(yè)圖1。

圖1 三組肝細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)結(jié)果（Q1：機(jī)械損傷；Q2：中晚期凋亡；Q3：正常；Q4：早期凋亡）

圖2 三組肝細(xì)胞ROS含量流式檢測(cè)結(jié)果

圖3 三組肝細(xì)胞熒光顯微鏡下表現(xiàn)（JC-1染色 ×200）

表1 三組肝細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表1 三組肝細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；對(duì)照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組、治療組均用內(nèi)含濃度為1.0mmol/L的游離脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）培養(yǎng)基培養(yǎng)，治療組加 20μmol/L 姜黃素

組別對(duì)照組模型組治療組F值P值孔數(shù)5 5 5早期凋亡率0.55±0.08 10.34±0.13*0.83±0.35△1957.51 0.00中晚期凋亡率1.59±0.87 2.96±0.04 2.28±0.82 2.94 0.13總凋亡率2.15±0.91 13.30±0.10*3.11±1.06△175.85 0.00

2.2 三組肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量比較 三組間ROS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；模型組肝細(xì)胞ROS含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），治療組低于模型組（P＜0.05），見表2、插頁(yè)圖2。

2.3 三組肝細(xì)胞線粒體膜電位的比較 肝細(xì)胞JC染色后采用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測(cè)，紅/綠熒光比值代表線粒體膜電位。三組間線粒體膜電位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）；模型組的線粒體膜電位低于對(duì)照組（P＜0.05），治療組該指標(biāo)較模型組升高，但仍低于對(duì)照組（P＜0.05），見表2、插頁(yè)圖3。

3 討論

NASH的持續(xù)存在已成為肝硬化甚至肝癌的重要因素之一，約有10%～25%的NASH患者在10～20年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌[2]。肝細(xì)胞凋亡在NASH的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)NASH患者肝組織活檢標(biāo)本的肝細(xì)胞凋亡數(shù)較單純脂肪肝組或正常對(duì)照組顯著升高，并隨NASH炎癥及纖維化嚴(yán)重程度增加而增加[3]。本實(shí)驗(yàn)通過1mmol/L的FFA干預(yù)正常人肝細(xì)胞來建立NASH的體外細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞的早期凋亡率及總凋亡率均較對(duì)照組高（P＜0.05），再次證實(shí)了肝細(xì)胞凋亡在NASH發(fā)展中的作用。

表2 三組肝細(xì)胞的ROS含量及線粒體膜電位比較（±s）

表2 三組肝細(xì)胞的ROS含量及線粒體膜電位比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組，△P＜0.05；對(duì)照組用原培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組、治療組均用內(nèi)含濃度為1.0mmol/L的游離脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）培養(yǎng)基培養(yǎng)；ROS：活性氧

組別對(duì)照組模型組治療組F值P值孔數(shù)5 5 5 ROS含量187.24±10.60 233.58±8.00*192.57±23.86△7.76 0.02線粒體膜電位1.25±0.04 1.08±0.03*1.17±0.04△16.23 0.00

近年研究發(fā)現(xiàn)，NASH動(dòng)物模型及患者肝臟中均存在線粒體結(jié)構(gòu)及功能的異常，包括線粒體呼吸鏈異常、ROS生成增加、腺苷三磷酸（ATP）合成減少及線粒體膜電勢(shì)損傷等[4]，而這些改變是肝細(xì)胞凋亡的主要原因，同時(shí)病理?xiàng)l件下的過度肝細(xì)胞凋亡，不僅直接破壞肝細(xì)胞并損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，而且使活化的肝星狀細(xì)胞（HSC）與庫(kù)普弗細(xì)胞，釋放大量炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝臟纖維化的形成和進(jìn)展[3，5]。高脂飲食喂養(yǎng)的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）模型中，肝細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)伴隨著線粒體膜轉(zhuǎn)換孔開放及凋亡蛋白含量的改變[6]。

姜黃素對(duì)非腫瘤細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡作用已被證實(shí)，且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素可顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝細(xì)胞凋亡水平[1]。本研究結(jié)果證實(shí)了姜黃素的抗細(xì)胞凋亡作用，同時(shí)，姜黃素顯著降低了ROS的生成[7-8]。線粒體是ROS生成的主要部位，線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑，而膜電位是反應(yīng)線粒體功能的重要指標(biāo)，Dai等[9]在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理可明顯改善呋喃唑酮誘導(dǎo)的LO2肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，顯著減低線粒體膜電位的喪失及促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。本研究首次將姜黃素用于FFA誘導(dǎo)的NASH細(xì)胞模型并檢測(cè)線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示，與模型組相比，該指標(biāo)的組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明姜黃素可保護(hù)線粒體膜電位。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明姜黃素降低ROS的生成及肝細(xì)胞凋亡，減弱線粒體膜電位的損傷，故姜黃素的抗凋亡作用可能與其線粒體保護(hù)作用相關(guān)。