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    低頻電針對紫杉醇誘發(fā)周圍神經(jīng)痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1表達的影響

    2019-06-03 10:48:46李園園李清林尹誠語臺燕劉伯宇胡奇妙項璇兒鄭小莉劉伯一方劍喬
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)痛造模紫杉醇

    李園園李清林尹誠語臺燕劉伯宇胡奇妙項璇兒鄭小莉劉伯一方劍喬

    1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江省腫瘤醫(yī)院3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)研究院

    隨著全球惡性腫瘤發(fā)病率的不斷上升,抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用日益增多。如紫杉醇(paclitaxel,PTX),作為臨床常用的化療藥物,從紅豆杉中提取,通過促進細(xì)胞內(nèi)微管蛋白聚合保持其穩(wěn)定,進而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[1],廣泛應(yīng)用于實體瘤如乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的化學(xué)治療[2]。化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)痛是化療藥物最常見的不良反應(yīng)。紫杉醇等化療藥物誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變(chemotherapy-induced peripheral neuropathy,CIPN)表現(xiàn)為手足疼痛感或麻木等癥狀,對鎮(zhèn)痛藥具有抵抗力,是一種難治性痛癥[3]。由于對其機制缺乏深入研究,目前尚無療效顯著的治療措施。因此,尋找能有效干預(yù)紫杉醇誘發(fā) CIPN的方法并闡明其機理,是現(xiàn)在急切需要解決的問題。

    瞬時感受器電位香草酸受體1型(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)屬于瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP) 離子通道家族的瞬時感受器電位香草酸受體(transient receptor potential vanilloid,TRPV)家族,主要在中、小直徑背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元中表達[4-5],是一類與疼痛密切相關(guān)的離子通道,是生理病理性疼痛的關(guān)鍵因素[6-7]。有研究報道,在外周神經(jīng)損傷模型[8-9]中,如紫杉醇誘發(fā)的CIPN大鼠模型,大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV1的表達上調(diào)[10-12]。應(yīng)用TRPV1拮抗劑、華蟾素等可通過抑制大鼠DRG中TRPV1的過表達逆轉(zhuǎn)紫杉醇誘導(dǎo)的機械痛過敏[11-12]。

    電針(electroacupuncture,EA)是目前公認(rèn)的有效控制疼痛的重要手段之一,具有副作用小、價格便宜、臨床易于推廣的優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于各類急慢性疼痛的治療。實驗研究證明低頻電針可抑制TRPV1的活化,并且對于周圍神經(jīng)痛具有較優(yōu)鎮(zhèn)痛效應(yīng)[14-16],如紫杉醇誘發(fā)CIPN[17-18],但其機制是否與干預(yù)DRG中TRPV1過表達有關(guān),目前尚未有明確報道。本實驗擬通過建立紫杉醇誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)痛大鼠模型,觀察造模后大鼠右足足底機械縮足反應(yīng)閾值(paw withdrawal thresholds,PWTs)的變化。采用電針干預(yù)及免疫熒光方法,通過觀察低頻電針對紫杉醇誘發(fā) CIPN大鼠模型疼痛行為學(xué)變化以及對 DRG中 TRPV1表達的干預(yù)作用,探討低頻電針治療紫杉醇誘發(fā)大鼠 CIPN的可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠42只,體質(zhì)量200~220g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng),許可證號:SCX(滬)2008-0016。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由實驗動物中心提供)及自由飲水,12h循環(huán)燈光,室溫(23±2)℃。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

    1.2 主要試劑及儀器 藥用級紫杉醇(安素泰,澳大利亞),兔抗大鼠Anti-VR1多克隆抗體(美國Abcam,產(chǎn)品貨號:ab6166),驢抗兔 IgG H&L(美國 Abcam,產(chǎn)品貨號:ab150061),其余試劑均為市售分析純級。纖毛機械刺激針(von Frey Hairs test觸覺纖維絲,美國 stoelting),韓式穴位神經(jīng)刺激儀(型號:HANS-200A,聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司),全能臺式高速冷凍離心機(型號:Sorvall Biofuge Stratos,美國 Thermo Scientific公司),Thermo冰凍切片機(型號:HM550,美國 Thermo Scientific公司),激光共聚焦顯微鏡(型號:NiKON Elements AR,日本Nikon公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 分組 用于建立模型的14只大鼠完全隨機分為2組:溶劑組、紫杉醇組,每組7只;用于研究電針干預(yù)紫杉醇誘發(fā) CIPN及 TRPV1通道表達的28只大鼠完全隨機分為溶劑組、紫杉醇組、紫杉醇+電針組、紫杉醇+假電針組,每組7只。

    1.3.2 動物模型制備 參照已有學(xué)者成功制備大鼠紫杉醇誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理痛模型的方法[19,20],將藥物級紫杉醇用0.9%無菌鹽水從原液濃度6mg/ml稀釋至1mg/ml,并且以2mg/kg的劑量每隔1天腹腔(i.p.)給藥,共進行 4 次注射(第 1、3、5、7d),達到最終累積劑量為8mg/kg,建立 CIPN模型。溶劑組僅接受等量無菌生理鹽水。

    1.3.3 治療干預(yù) 溶劑組、紫杉醇組不做任何電針處理。紫杉醇+電針組:第10d,介入電針干預(yù),選取雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴(參照華興邦大鼠穴位圖譜)[21],采用0.18mm×13mm毫針,進針后連接“LH-200A韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀”,治療參數(shù):波形為連續(xù)波,頻率 2Hz,強度 0.5~1.5mA(開始 0.5mA,每 10min 增加0.5mA),共 30min,1次/d,至實驗結(jié)束。紫杉醇+假電針組:選穴及干預(yù)時間同電針組,進針至皮下不超過2mm深度,連接“LH-200A韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀”,不開機,持續(xù)30 min,1次/d,至實驗結(jié)束。

    1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

    1.4.1 PWTs檢測 參照參考文獻[22],第一部分于大鼠第 0、2、4、6、8、15 和 22d 時間點 PWTs 作為痛閾指標(biāo);第二部分于大鼠第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18d時間點PWTs作為痛閾指標(biāo)。測量前,先將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上透明有機玻璃罩(20cm×20cm×15cm)內(nèi),適應(yīng)環(huán)境30min。待其安靜后,選取0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g 總計 11 種強度的von Frey絲,最先使用4.0g強度的von Frey絲進行檢測。von Frey絲對準(zhǔn)大鼠右側(cè)后足足底(避開足墊),緩慢上抬von Frey絲,至纖維絲彎曲成S形,連續(xù)刺激5s。如大鼠未產(chǎn)生逃避反應(yīng),記為“O”并換取高一個強度的纖維絲刺激,直至大鼠產(chǎn)生逃避反應(yīng)。如大鼠產(chǎn)生逃避反應(yīng),記為“X”并換取低一個強度的纖維絲刺激,直至大鼠不產(chǎn)生逃避反應(yīng)。連續(xù)進行6次測量,每次刺激間最小間隔2min。記錄大鼠一系列反應(yīng)。按如下公式進行痛閾計算:50%PWTs(g)=10^(xf+κ*δ-4)。公式中各值含義為:Xf代表最后一次測量的von Fery絲強度,κ值代表up and down法中陽性(X)/陰性(O)反應(yīng)參數(shù)表內(nèi)參考值,查表后獲得,δ為各個強度 von Frey絲力度取對數(shù)后差值的平均值,在此約等于0.185。設(shè)定最大刺激強度26g,最小刺激強度為0.4g。若計算得出50%PWTs大于26.0g或小于0.4g,仍以26.0g或0.4g作為最大或最小值。行為學(xué)測量時間固定在9:00-16:00,環(huán)境溫度:23±2℃。

    1.4.2 取材及樣本處理 第一部分實驗于第22d;第二部分實驗于第18d,完成痛閾測量后,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,注射劑量為0.35ml/100g。開胸暴露心臟,經(jīng)升主動脈快速灌注4℃生理鹽水,快速推注4%多聚甲醛約150ml,再予4%多聚甲醛緩慢滴注15min左右,待大鼠肢體僵硬,快速取出L4-6 DRG,放入含有4%多聚甲醛的 EP管內(nèi),固定3h,依次置于15%(24h,沉底)、30%(48h,沉底)蔗糖溶液脫水,液氮速凍,-80℃保存。

    1.4.3 免疫熒光染色 用冷凍切片機進行冷凍冠狀位連續(xù)切片,采用貼片法,切片厚度10μm,每6個層次取1張切片,每只大鼠一個節(jié)段DRG切取10張玻片,隨機取4張熒光圖片進行熒光統(tǒng)計。切片滴加5%正常山羊血清 37℃封閉1h,滴加一抗(兔抗大鼠TRPV1 ab6166,1:400)4℃孵育過夜,滴加二抗(驢抗兔 ab150061,1:600)37℃避光孵育 1h,滴加抗熒光淬滅封片液(美國Abcam,產(chǎn)品貨號:ab104139),蓋玻片封片。激光掃描共焦熒光顯微鏡下觀察并攝片用Nikon Elements AR Analysis軟件(Nikon公司)進行陽性細(xì)胞及直徑大小的計數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所有資料采用±s表示。兩組間比較采用獨立樣本Student’s t檢驗,多組間比較采用重復(fù)測量方差分析和單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較,方差齊性時采用最小顯著性差異法(Least—Significant Difference,LSD)檢驗,方差不齊時采用 Dunnett’s T3檢驗,均以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 紫杉醇對大鼠50%PWTs的影響 如圖1A所示進行模型建立和實驗觀察。如圖1B所示,紫杉醇溶液注射前,各組大鼠 50%PWTs比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。造模后1d,與溶劑組相比,紫杉醇組大鼠50%PWTs下降(P<0.01),并且隨著時間的推移持續(xù)下降到第21d(P<0.01)。而溶劑組大鼠閾值保持穩(wěn)定沒有下降。圖1C所示曲線下面積也顯示紫杉醇造模后,兩組大鼠出現(xiàn)顯著差異(P<0.01)。以上結(jié)果說明紫杉醇誘導(dǎo)周圍神經(jīng)痛模型造模成功。

    2.2 紫杉醇對大鼠 L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1表達的影響 如圖2A及2B所示,造模后,紫杉醇組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1表達陽性神經(jīng)元個數(shù)相比溶劑組出現(xiàn)增多現(xiàn)象。圖2B為圖2A細(xì)胞個數(shù)統(tǒng)計圖,統(tǒng)計后數(shù)據(jù)顯示,與溶劑組相比,紫杉醇組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1表達陽性神經(jīng)元個數(shù)顯著增多(P<0.01)。圖2C表明紫杉醇組增多的TRPV1陽性表達神經(jīng)元主要集中于中、小直徑 DRG神經(jīng)元。

    2.3 電針對紫杉醇誘發(fā)大鼠CIPN的干預(yù)作用 如圖3A所示,進行模型建立和實驗觀察。圖3B顯示造模前各組大鼠50%PWTs比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。圖3B顯示造模后,與溶劑組相比,紫杉醇組、紫杉醇+電針組、紫杉醇+假電針組50%PWTs顯著下降(均P<0.01)。電針干預(yù)后,與紫杉醇+假電針組相比,紫杉醇+電針組50%PWTs上調(diào)(P<0.01)。紫杉醇+假電針組50%PWTs與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖3C所示的曲線下面積統(tǒng)計圖與圖3B結(jié)論一致。

    2.4 低頻電針對紫杉醇誘發(fā)CIPN大鼠L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1過表達現(xiàn)象的干預(yù)作用 如圖4A所示,電針干預(yù)后,紫杉醇組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細(xì)胞較溶劑組增多;紫杉醇+電針組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細(xì)胞較紫杉醇+假電針組、紫杉醇組減少;圖4B為4A統(tǒng)計圖,與溶劑組相比,紫杉醇組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細(xì)胞顯著增多(P<0.01)。與紫杉醇組+假電針組相比,紫杉醇+電針組大鼠右側(cè) L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細(xì)胞顯著減少(P<0.01)。而與紫杉醇組相比,紫杉醇+假電針組大鼠右側(cè)L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細(xì)胞表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。圖4C表明電針可以顯著減少紫杉醇所導(dǎo)致的TRPV1在中小直徑 DRG神經(jīng)元中的過表達作用。

    3 討論

    圖1 紫杉醇對大鼠不同時間點50%PWTs的影響Fig.1 The effects of paclitaxel on 50%PWTs at different time points in rats

    化療誘發(fā)的周圍神經(jīng)痛是抗癌治療中常見并發(fā)癥,其主要癥狀為感覺異常、麻木和疼痛,目前缺乏有效的預(yù)防和治療措施,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[23]。在所有化療藥物中,紫杉醇誘發(fā)周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率為60%~70%[24]。本實驗結(jié)果顯示,隔天腹腔注射2mg/kg紫杉醇,紫杉醇組大鼠右側(cè)50%PWTs均顯著下降,且在整個實驗期間均維持在較低水平,與溶劑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,表明成功建立大鼠周圍神經(jīng)痛模型。該結(jié)果與以往研究結(jié)果相一致[19,25]。

    現(xiàn)代研究表明,電針對慢性痛具有良好的鎮(zhèn)痛效果[26-27],而低頻電針不僅通過抑制TRPV1的活化治療神經(jīng)痛[15-16],對紫杉醇誘發(fā)CIPN同樣具有治療作用[17-18]。本實驗結(jié)果顯示,造模后進行電針干預(yù),紫杉醇+電針組大鼠的50%PWTs相對紫杉醇組明顯升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此,表明低頻電針干預(yù)可降低紫杉醇誘發(fā)CIPN的機械痛痛覺過敏,這一結(jié)果與以往報道相一致[17-18]。

    圖2 各組大鼠右側(cè)L4-6 DRG神經(jīng)元 TRPV1表達水平(免疫熒光,10x)(±sem)Fig.2 The expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)

    TRPV1是一種與疼痛密切相關(guān)的非選擇性陽離子通道,它同時參與了慢性痛外周敏化和疼痛中樞調(diào)制[28]。大量研究表明,TRPV1參與紫杉醇誘發(fā)CIPN的痛覺過敏[11,29]。以往研究表明,疼痛模型大鼠的小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1的表達增加[30]。本實驗發(fā)現(xiàn),紫杉醇造模后18d及22d,紫杉醇大鼠右側(cè)DRG中TRPV1表達明顯高于溶劑組。免疫組織化學(xué)分析表明紫杉醇大鼠的中、小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1表達顯著增加。該結(jié)果提示,中、小直徑 DRG神經(jīng)元中TRPV1的上調(diào)可能介導(dǎo)紫杉醇誘發(fā)CIPN的機械痛痛覺過敏。本實驗發(fā)現(xiàn)紫杉醇+電針組大鼠右側(cè)DRG中TRPV1的表達明顯低于紫杉醇組、紫杉醇+假電針組。以上結(jié)果表明,低頻電針可有效抑制中、小直徑DRG神經(jīng)元TRPV1的過表達。以往研究表明抑制脊髓背角中TRPV1的活化可介導(dǎo)電針治療炎性痛和神經(jīng)病理痛[31],但并不清楚抑制DRG中TRPV1的上調(diào)是否介導(dǎo)低頻電針治療CIPN以及電針是否通過其他通路調(diào)控 TRPV1的表達。已有研究表明TLR4參與紫杉醇誘發(fā)CIPN[32],并可增強感覺神經(jīng)元中TRPV1的活化[33],并在DRG神經(jīng)元中共定位,使用TLR4抑制劑,可降低DRG中TRPV1的過表達,并逆轉(zhuǎn)已經(jīng)出現(xiàn)的痛覺過敏[34-36]。因此,DRG中TLR4可能通過誘導(dǎo)TRPV1的高表達及活化進而參與調(diào)節(jié)紫杉醇誘發(fā)CIPN。

    圖3 電針治療后,紫杉醇對大鼠不同時間點50%PWTs的影響Fig.3 The effects of 2Hz EA or Sham EA treatment on 50%PWTs of rat CIPN model

    本研究從低頻電針干預(yù)CIPN的角度出發(fā),深入探討了低頻電針對CIPN產(chǎn)生的干預(yù)作用的可能機制,通過觀察低頻電針對DRG中TRPV1過表達的干預(yù)作用,探索電針干預(yù)CIPN的外周神經(jīng)調(diào)節(jié)機制。綜上研究發(fā)現(xiàn)可知,低頻電針可以有效緩解CIPN,使50%PWTs升高,其作用機制可能與其下調(diào)中、小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1的過表達水平有關(guān),但低頻電針是否通過TLR4-TRPV1通路干預(yù)紫杉醇誘發(fā)CIPN的深層次機制有待進一步研究,這一研究將有助于為針灸治療CIPN提供可能靶點,揭示低頻電針治療CIPN的機制,并為推動電針進一步應(yīng)用于CIPN的臨床治療提供理論依據(jù)。

    圖4 電針治療后,各組大鼠右側(cè)L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1表達水平變化(免疫熒光,10x)(±sem)Fig.4 Effect of 2Hz EA or Sham EA on expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)

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