血清磷脂酶A2組ⅡA和凝血因子Ⅸ篩查耐多藥肺結(jié)核病氣陰兩虛證的應(yīng)用研究

胡玉婷溫成平江婷婷范永升李繼承,3

1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院 廣州 510006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 3.浙江大學(xué)

耐多藥肺結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）是結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis，Mtb.）感染引起的、至少對(duì)異煙肼和利福平兩種藥效最強(qiáng)的一線抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核病[1]。僅2016年全球就有49萬(wàn)例MDR-TB新發(fā)病例和約24萬(wàn)例死亡病例[1]。MDR-TB的傳統(tǒng)二線治療方案存在嚴(yán)重缺陷，包括治療周期長(zhǎng)、不良反應(yīng)嚴(yán)重等，導(dǎo)致患者耐受性差，死亡率增加[1-3]，因此，迫切需要控制MDR-TB治療藥物的不良反應(yīng)，以提高療效[2]。

研究已證實(shí)，中醫(yī)藥具有減輕抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)、增強(qiáng)患者免疫力和抑制Mtb.生長(zhǎng)等作用，治療普通肺結(jié)核病和MDR-TB的療效顯著[4-7]。中醫(yī)在“辨證施治”的原則下，根據(jù)MDR-TB證候的不同來(lái)選擇不同藥物進(jìn)行治療。MDR-TB證候一般分為肺陰虛（pulmonary Yin deficiency，PYD）證、陰虛火旺（hyperactivity of fire due to Yin deficiency，HFYD） 證、氣陰兩虛（deficiency of Qi and Yin，DQY）證和陰陽(yáng)兩虛（deficiency of Yin and Yang，DYY）證，其中 DQY證患者最多[8-12]。然而，由于MDR-TB證候分類缺乏分子生物學(xué)基礎(chǔ)，導(dǎo)致其證候分類不夠準(zhǔn)確，從而在一定程度上影響了中醫(yī)治療MDR-TB的療效，因此需要建立MDR-TB中醫(yī)證候診斷的客觀標(biāo)準(zhǔn)[13-17]。由于DQY證患者人數(shù)在MDR-TB四種證候中最多，控制MDR-TB DQY證的病情對(duì)控制MDR-TB的疫情十分重要，因此急需建立MDR-TB DQY證診斷的客觀標(biāo)準(zhǔn)。

磷脂酶A2組ⅡA（phospholipase A2 groupⅡA，PLA2G2A）是磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）家族成員，不僅可釋放游離脂肪酸和溶血磷脂，影響機(jī)體脂肪酸含量，其表達(dá)水平還與炎性疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。凝血因子Ⅸ（coagulation factor Ⅸ，F(xiàn)9）是維生素K依賴性血漿蛋白，參與血液凝固的內(nèi)源性途徑。有研究證實(shí)，宿主體內(nèi)的脂肪酸是Mtb.的碳源和能量來(lái)源之一，脂肪酸對(duì)Mtb.在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在和耐藥性產(chǎn)生有重要作用，提示MDR-TB的發(fā)生、發(fā)展與宿主脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[19-21]。臨床上MDR-TB不同證候的患者不僅存在程度不同的慢性炎癥反應(yīng)，而且還存在不同程度的凝血功能紊亂，提示MDR-TB DQY證的生物學(xué)基礎(chǔ)可能與PLA2G2A和F9的表達(dá)密切相關(guān)。因此，本研究將采用ELISA法，探索血清PLA2G2A、F9與MDR-TB DQY證的關(guān)系，以及PLA2G2A和F9作為MDR-TB DQY證潛在生物學(xué)標(biāo)志物的可能性，以期闡明MDR-TB DQY證的生物學(xué)基礎(chǔ)，為MDR-TB DQY證的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2013年4月至2018年4月在紹興市立醫(yī)院中醫(yī)科和嘉興市第一醫(yī)院結(jié)核科病房及門診就診的MDR-TB患者共88例，其中MDR-TB PYD證患者21例、MDR-TB HFYD證患者29例、MDR-TB DQY證患者37例、MDR-TB DYY證患者1例。由于DYY證候是MDR-TB患者瀕臨死亡的階段，樣本不易取得，故本研究只對(duì)MDR-TB PYD證、HFYD證、DQY證進(jìn)行研究。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法從上述21例PYD證患者、29例HFYD證患者和37例DQY證患者中各隨機(jī)挑選出15例MDR-TB患者，分別作為MDR-TB PYD證組、MDR-TB HFYD證組和MDR-TB DQY證組。此外，收集浙江醫(yī)院2017年3月體驗(yàn)的健康人群30例，并應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取15例作為健康對(duì)照（healthy control，HC）組。各組研究對(duì)象一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者在抽血前均獲得書面知情同意，研究中使用的所有方法均遵循批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針和規(guī)定。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 本研究納入和排除標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部發(fā)布的《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[22]和WHO修訂的國(guó)際結(jié)核病控制條例[23]，所有MDR-TB患者都符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診為肺結(jié)核??；（2）藥敏試驗(yàn)確認(rèn)對(duì)異煙肼和利福平兩種一線抗結(jié)核藥物耐藥。同時(shí)排除患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、重要器官和系統(tǒng)慢性器質(zhì)性疾病或合并艾滋病毒感染等感染性疾病的MDR-TB患者。根據(jù)中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[24]中肺癆的中醫(yī)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)和證候分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有MDR-TB患者均經(jīng)中醫(yī)辨證，分別符合PYD證、HFYD證、DQY證和DYY證，具體證候詳見(jiàn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中的肺癆證候診斷部分。

1.3 ELISA檢測(cè)受試者血清中PLA2G2A和F9的蛋白濃度 采用ELISA法分別定量檢測(cè)各組受試者血清中PLA2G2A和F9的蛋白濃度。PLA2G2A（人）ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)RayBiotech公司（貨號(hào)：ELHPLA2G2A），稀釋倍數(shù)1:10；F9（人）ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Abcam公司（貨號(hào)：ab108831），稀釋倍數(shù)1:400。以上試劑盒用于測(cè)定45例MDR-TB患者（15例PYD證、15例HFYD證和15例DQY證）和15例HC受試者血清PLA2G2A和F9蛋白濃度的變化，運(yùn)用酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品）在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，具體操作依據(jù)試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析及事后Dunnett多重比較測(cè)試（Dunnett's multiple comparisons test）。計(jì)數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用MedCalc Version 12.4.2.0軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲線，ROC 曲線指標(biāo)包括靈敏度（sensitivity）、特異度（specificity）、曲線下面積（area under the ROC curve，AUC），用以評(píng)估每個(gè)潛在生物學(xué)標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同證候MDR-TB患者一般資料比較 88例MDR-TB患者中DQY證的患者數(shù)最多，其次是HFYD證，再者是DQY證，而DYY證患者最少，各證候間年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組受試者臨床資料比較 各組受試者的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 不同證候MDR-TB患者一般資料比較

表2 各組受試者一般資料比較

與 HFYD證組比較，DQY證組血尿酸（uric acid，UA）水平顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。與PYD證組比較，DQY證組纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）水平均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，P=0.048）。見(jiàn)表 3。

表3 各組受試者血生化指標(biāo)比較

2.3 各組受試者血清F9和PLA2G2A表達(dá)比較 各組受試者F9的蛋白濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，HC組明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），且DQY證組的蛋白濃度明顯低于HFYD證組（P＜0.05）。各組受試者血清PLA2G2A的蛋白濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），DQY證組PLA2G2A的蛋白濃度明顯高于PYD證組、HFYD證組和HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表 4、圖 1。

2.4 MDR-TB DQY證潛在生物學(xué)標(biāo)志物的ROC分析 為了研究F9和PLA2G2A診斷MDR-TB DQY證的效果，以ROC曲線評(píng)估其AUC、靈敏度和特異度。將MDR-TB DQY證組的診斷指標(biāo)設(shè)為1，MDRTB PYD證組、MDR-TB HFYD證組和HC組分別均設(shè)為0。結(jié)果顯示，PLA2G2A分別用于鑒別MDR-TB DQY證和PYD證、MDR-TB DQY證和HFYD證，以及MDR-TB DQY證和HC的準(zhǔn)確性一般，而F9鑒別MDR-TB DQY證和HFYD證、MDR-TB DQY證和HC的準(zhǔn)確性較好。見(jiàn)表5-6、圖2。

3 討論

肺結(jié)核病是中國(guó)第二大傳染病。由于中國(guó)部分地區(qū)人口密度高，衛(wèi)生條件較差，因此不管是藥物敏感性肺結(jié)核病還是MDR-TB的發(fā)病人數(shù)均較多[1,25-27]。從全球范圍看，MDR-TB同樣也是一項(xiàng)公共衛(wèi)生安全問(wèn)題，因?yàn)榕c普通肺結(jié)核病患者相比，MDR-TB患者對(duì)藥物的耐受性更差，生存期更短，死亡率更高[2,28-29]。中醫(yī)根據(jù)MDR-TB的不同證候，選擇與證候?qū)?yīng)的藥物對(duì)MDR-TB進(jìn)行針對(duì)性治療，可獲得良好的治療效果[6,30]。

表4 各組受試者血清F9和PLA2G2A表達(dá)比較

圖1 各組受試者血清F9和PLA2G2A表達(dá)比較

表5 血清PLA2G2A鑒別診斷MDR-TB DQY證的ROC分析

表6 血清F9鑒別診斷MDR-TB DQY證的ROC分析

MDR-TB DQY證的病機(jī)為機(jī)體元?dú)獠蛔?，陰傷氣耗，?dǎo)致肺脾兩虛[31]。肺脾同病，陰傷氣耗，清肅失司，肺不主氣而為咳，氣不化津而成痰，肺虛絡(luò)損則痰中帶血，氣虛不能衛(wèi)外，陽(yáng)陷入陰，故見(jiàn)氣虛身熱、怕風(fēng)、自汗；陰虛則內(nèi)熱、盜汗；脾虛不健則食少、便溏；氣陰兩傷故面白顴紅、舌質(zhì)嫩紅、脈細(xì)弱而數(shù)[32-33]。MDRTB DQY證的治法以益氣、養(yǎng)陰為主，常用保真湯治療。臨床上，由于MDR-TB患者病程較長(zhǎng),且病情遷延不愈,導(dǎo)致患者以DQY證為主,其次是HFYD證,而最少的則是PYD證，這與本研究發(fā)現(xiàn)一致。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了臨床生化指標(biāo)與MDR-TB DQY證型之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，與PYD證患者相比，DQY證患者血液中FIB和IgG水平更高。FIB和IgG與凝血和炎癥反應(yīng)相關(guān)[34-35]，提示DQY證患者凝血功能紊亂、炎癥反應(yīng)活躍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PLA2G2A在MDR-TB DQY證中高表達(dá)。PLA2G2A是PLA2家族的成員，是一種低分子量并需要鈣離子催化的細(xì)胞外酶，能催化磷酸甘油酯的sn-2脂肪酸?；ユI水解，釋放游離脂肪酸和溶血磷脂，影響機(jī)體脂肪酸含量。PLA2G2A在MDR-TB DQY證中高表達(dá)，提示MDR-TB DQY證患者體內(nèi)脂肪酸含量可能發(fā)生上調(diào)，而脂肪酸是Mtb.合成自身細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要碳源和能量來(lái)源[19-20]，脂肪酸含量上調(diào)不僅可以保護(hù)Mtb.免受抗結(jié)核藥物和宿主炎性細(xì)胞因子的影響，而且還可以促進(jìn)Mtb.在體內(nèi)持續(xù)存在和傳播[16-21]。同時(shí)，PLA2G2A被稱為“炎性sPLA2”、在炎性刺激作用下其表達(dá)顯著上調(diào)，與炎性疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，這提示PLA2G2A水平可能與MDR-TB DQY證患者表現(xiàn)出的炎癥反應(yīng)程度有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示DQY證患者的PLA2G2A水平最高，提示其炎癥反應(yīng)程度最強(qiáng)。然而，DQY證雖被認(rèn)為是MDR-TB病情較嚴(yán)重的證型，其患者通常表現(xiàn)為咳嗽無(wú)力、氣短聲低、神疲乏力等消耗性癥狀，一般情況下其炎癥反應(yīng)程度卻弱于HFYD證。因此，PLA2G2A的水平與炎癥反應(yīng)程度的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。此外，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步提示PLA2G2A在DQY證中過(guò)度表達(dá)可能與其他原因有關(guān)，這也值得進(jìn)一步研究。

圖2 血清PLA2G2A和F9鑒別診斷MDR-TB DQY證的ROC分析

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，MDR-TB DQY證中F9表達(dá)低于HFYD證，提示DQY證患者凝血功能與HFYD證不同。F9是維生素K依賴性凝血因子，其作為無(wú)活性的酶原在血液中循環(huán)。它的活化形式F9a通過(guò)與Ca2+離子、膜磷脂和F8的相互作用將F10活化為其活性形式F10a，從而參與血液凝固的內(nèi)源性途徑，調(diào)節(jié)機(jī)體凝血反應(yīng)。臨床上，MDR-TB DQY證患者表現(xiàn)為痰中偶帶血，血色淡紅，而HFYD證患者表現(xiàn)為時(shí)時(shí)咯血，且血色鮮紅[31-33]，提示MDR-TB DQY證和HFYD證凝血功能確有不同，而F9表達(dá)差異可能與MDR-TB HFYD證患者咯血量多導(dǎo)致的機(jī)體代償有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以ROC曲線評(píng)估了PLA2G2A和F9作為MDR-TB DQY證潛在生物學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示PLA2G2A鑒別MDR-TB DQY證和PYD證、鑒別MDR-TB DQY證和HFYD證、鑒別MDR-TB DQY證和HC的AUC在均0.6～0.7之間，說(shuō)明其診斷準(zhǔn)確性一般，而F9雖然能良好地鑒別MDR-TB DQY證與HFYD證和HC，但卻不能鑒別DQY證和PYD證。PLA2G2A和F9診斷MDR-TB DQY證的準(zhǔn)確性均不是很高，其原因可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，以及人體的個(gè)體生理差異較大有關(guān)，后續(xù)可通過(guò)加大樣本量，以提高其準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究提示PLA2G2A可以作為一種新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，應(yīng)用于MDR-TB DQY證的初步篩查；F9在MDR-TB DQY證的表達(dá)量低于HFYD證，與MDR-TB凝血功能異常有關(guān)。該研究不僅為MDR-TB DQY證的診斷提供了生物學(xué)依據(jù)，而且也為研究中醫(yī)證候的客觀分類提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和科學(xué)方法，對(duì)量化中醫(yī)證候、實(shí)現(xiàn)中醫(yī)證候現(xiàn)代化具有重要意義。