骨膜去細胞生物支架在骨缺損小鼠體內(nèi)的血管化機制

張學銘，陳俊豪，陳雷，李曉航，汪開誠，林瓊瓊，金可可

（1.溫州醫(yī)科大學 病理學與病理生理學教研室，浙江 溫州 325035；2.University of Western Australia，Perth WA6009；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；5.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325027）

骨缺損、骨不愈是臨床上常見的骨科難治性疾病，近年來骨組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展為骨缺損的治療提供了新的方法和理念，其基本原理是制備優(yōu)良的支架材料以搭載合適的種子細胞及生物因子，完成目標區(qū)域的功能重建[1]。骨膜具有較強的成骨能力，在骨折愈合修復(fù)方面具有重要作用，被認為是促進骨移植材料在移植區(qū)域發(fā)揮修復(fù)作用的始動因素[2]。骨膜去細胞生物支架去除了具有免疫源性的細胞成分并基本保留了細胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)和重要組分，在異體皮下包埋實驗中展現(xiàn)出了良好的生物相容性[3]。研究表明支架材料是誘導(dǎo)種子細胞黏附、增殖、分化并維持功能的重要載體，其血管化是實現(xiàn)組織工程體外培養(yǎng)構(gòu)建與體內(nèi)移植的重要途徑，是去細胞骨膜支架發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素[4-5]。目前對于骨膜去細胞生物支架的血管化研究國內(nèi)外罕見報道，因此本實驗觀察去細胞骨膜支架在小鼠股骨缺損模型中血管形成的作用及其對骨缺損的修復(fù)效果，并探討其血管化的機制，以期為后續(xù)該支架應(yīng)用于治療骨缺損、骨不愈提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康6周齡雄性C57BL/6小鼠64只，體質(zhì)量（23±3）g；健康4月齡雄性新西蘭白兔30只，體質(zhì)量（2.00±0.25）kg，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。動物實驗嚴格按照科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I，DNase 1，美國Sigma公司）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、青霉素、鏈霉素（美國Sigma公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，上海博谷生物科技有限公司）；Cell Counting Kit-8試劑盒（日本Dojindo公司）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）IgG（美國Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Epoch 微孔板分光光度計（美國BioTek公司）；Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 去細胞骨膜支架的制備 將游離的兔脛骨骨膜在-80 ℃下冷凍24 h后放于37.5 ℃水浴鍋中1 h，往復(fù)5個循環(huán)；取出骨膜放入1% Triton-X100 和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的脫細胞液中置于37 ℃恒溫震蕩機上震蕩12 h，PBS反復(fù)沖洗；放入1% SDS中繼續(xù)震蕩2 h；沖洗后將骨膜放于混有50 U/mL DNase 1酶消化酶液中30 min后，浸泡于0.1%過氧乙酸溶液消毒1 h，PBS充分沖洗后置于含100 U/mL的青、鏈霉素的PBS液中4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 支架浸提液的制備及VEGF測定 完全DMEM培養(yǎng)基浸泡支架72 h獲得支架浸提液，用于VEGF測定。參照試劑盒說明書用ELISA法檢測支架浸提液中VEGF水平。

1.5 骨膜去細胞支架浸提液細胞毒性檢驗 采用CCK-8法檢測骨膜去細胞支架浸提液對骨膜細胞增殖的影響。細胞分為正常對照組和支架浸提液組。正常對照組中加入DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL鏈霉素）]；支架浸提液組加入等量含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL鏈霉素）的支架浸提液。將HUVEC分別以5×103細胞/孔和10×103細 胞/孔的濃度接種于96孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中孵育。分別在第2天和第5天，用酶標儀在450 nm下測量細胞的吸光度，以上每組樣本檢測8個孔。

1.6 支架浸提液對HUVEC遷移的影響 采用細胞劃痕實驗觀察HUVEC遷移。實驗分為3組：①正常對照組；②支架浸提液組；③bFGF陽性對照組。正常對照組加入完全DMEM培養(yǎng)基，支架浸提液組加入等量的支架浸提液，陽性對照組中加入等量含5 ng/mL bFGF的DMEM培養(yǎng)基。HUVEC以5×105細胞/孔的濃度種在六孔板中，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃過夜。使用滅菌的黃色槍頭在孔板底部，垂直水平線劃出痕跡，用PBS輕柔沖洗干凈，將六孔板放入含5% CO2細胞培養(yǎng)箱在37 ℃孵育24 h。在0、12、24 h 拍攝照片，并使用ImageJ軟件計算各組細胞的遷移面積。

1.7 動物實驗 隨機將C57BL/6 小鼠分為對照組（n=16）和支架組（n=48）。使用1.5%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠（0.1 mL/20 g）；用4G針頭在小鼠股骨遠端上制作直徑0.5 mm的孔狀單皮質(zhì)缺損；將去細胞骨膜支架用打孔器制成直徑5 mm的圓片，并消毒備用。對照組小鼠在孔狀骨缺損制備完畢后，不放置任何材料，直接縫合肌肉和皮膚；支架組中，將消毒好的骨膜支架放置在股骨缺損處，適當固定后，縫合肌肉和皮膚。分別在第7天、第14天、第21天和第28天處死動物，取出股骨，4%多聚甲醛固定；37 ℃下用含12.5%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脫鈣溶液脫鈣。最后將骨膜支架進行石蠟包埋，切片備用。

1.8 去細胞骨膜支架的血管化觀察 通過HE染色觀察骨缺損區(qū)域和支架的修復(fù)情況。免疫熒光染色法觀察血管上的vWF。實驗步驟如下：石蠟切片厚度5 μm，常規(guī)脫蠟至水，并進行抗原修復(fù)；加入兔抗vWF抗體（1:100），4 ℃過夜；加入熒光標記的二抗抗體，37 ℃濕盒避光孵育30 min；4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）復(fù)染10 min，PBS沖洗5 min；甘油緩沖液封片；熒光顯微鏡下觀察，胞核呈藍色熒光，vWF的表達為綠色熒光。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料行正態(tài)性檢驗，實驗數(shù)據(jù)以±s表 示。組間比較采用單因素方差分析，多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗，方差齊者兩兩比較行SNK-q檢驗，方差不齊者行Duunet’s檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 支架浸提液的細胞毒性 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在第2天和第5天，2種細胞濃度的支架浸提液組和正常對照組的OD值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 細胞毒性實驗結(jié)果（n=8）

2.2 支架中VEGF的濃度 ELISA法檢測結(jié)果顯示，支架浸提液中的VEGF濃度為（210.75±4.81）pg/mL，高于正常對照組（完全DMEM培養(yǎng)基）的（21.00± 6.37）pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 細胞劃痕實驗 實驗結(jié)果顯示支架浸提液組細胞的遷移面積大于正常對照組，但小于bFGF陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 細胞劃痕實驗結(jié)果

2.4 支架的血管化觀察

2.4.1 HE染色：去細胞骨膜支架植入體內(nèi)7 d后，支架中有血管出現(xiàn)（見圖3）；在第14天，支架內(nèi)血管明顯增多；第21天時，支架中血管密度達到最大，血管內(nèi)可見少量紅細胞；第28天時，血管密度較第21天有所下降。

2.4.2 免疫熒光染色：第7天的支架內(nèi)出現(xiàn)綠色環(huán)狀熒光，數(shù)量較少；第14天，熒光量有所增加，且較局部分散；第21天，熒光量明顯增加，并且分布較均勻；第28天，熒光量較第21天時有所減少。提示支架內(nèi)血管生長呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，并于第21天的時間段內(nèi)達到最高水平（見圖3）。

圖3 支架的HE染色和免疫熒光染色（比例尺：50 μm）

2.5 骨缺損區(qū)域的修復(fù)情況 第7天，支架組骨缺損處觀察到肉芽組織和血管。在對照組中，骨缺損處僅觀察到纖維結(jié)締組織，未觀察到血管。第14天，支架組骨缺損處血管密度增加，并且出現(xiàn)骨樣礦化；對照組骨缺損處開始出現(xiàn)肉芽組織和血管。第21天，支架覆蓋的缺損處編織骨形成，出現(xiàn)骨樣結(jié)構(gòu)，對照組可觀察到骨樣礦化，但沒有編織骨形成。在第28 天，支架組骨缺損處皮質(zhì)骨完整包裹缺損處，骨纖維排列較規(guī)則，骨缺損的愈合較完整，對照組可觀察到骨樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則。見圖4。

3 討論

圖4 骨缺損處的HE染色（比例尺：100 μm）

本研究體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，去細胞骨膜支架對HUVEC的增殖沒有抑制作用，并且可以促進HUVEC的遷移，但是促遷移效果不如bFGF明顯。bFGF可以促進HUVEC遷移[6]，故本實驗中使用bFGF作為陽性對照組。有實驗研究[7-8]將支架與bFGF結(jié)合來促進支架生理功能的恢復(fù)，并取得了良好的效果。在后續(xù)進一步的實驗研究中，可以將bFGF和去細胞骨膜支架相結(jié)合，來增強支架的血管化，促進其修復(fù)能力的恢復(fù)。通過HE染色，我們觀察到支架中血管的數(shù)量和分布隨時間而呈現(xiàn)動態(tài)的變化。支架內(nèi)血管數(shù)量隨著在體內(nèi)時間的延長呈先增多后減少的趨勢，在第3周時支架內(nèi)血管密度達到最大，血管分布也更加均勻。vWF是一種黏著性多聚糖蛋白，主要表達于血管內(nèi)皮細胞表面[9]，故本實驗通過vWF特異性熒光染色來進一步鑒定支架中的血管生成情況。免疫熒光檢測到vWF的密度變化與HE染色中血管密度的變化呈現(xiàn)相同的趨勢。去細胞骨膜支架中血管在后期減少提示支架在體內(nèi)完成修復(fù)作用后，可能會逐步降解。在去細胞肌腱[10]和去細胞腎支架[11]的研究中均觀察到支架降解過程，其具體降解機制需要進一步的實驗研究觀察。在骨膜支架的浸提液中檢測到VEGF，提示支架的血管化機制可能是VEGF的刺激作用。VEGF在血管的生成和生長中起關(guān)鍵作 用[12]，其可以刺激內(nèi)皮細胞的存活、增殖、分化和運動，促進血管的增多和生長[13]，并有研究表明，其可以增強骨形態(tài)發(fā)生蛋白的誘導(dǎo)作用，促進新生骨的形成[14]。

通過4個不同時間點對支架組和對照組的小鼠骨缺損區(qū)域的修復(fù)情況的對比觀察，我們發(fā)現(xiàn)支架組小鼠的骨缺損處能夠在更短的時間內(nèi)出現(xiàn)血管，并長出排列規(guī)則的皮質(zhì)骨。支架對骨缺損的修復(fù)作用，一方面是因為支架本身對缺損區(qū)域的覆蓋保護作用，另一方面可能是支架內(nèi)血管為骨缺損的修復(fù)提供了良好的氧和營養(yǎng)供應(yīng)，并促進骨缺損區(qū)域的血管生成。

我們的實驗結(jié)果表明去細胞骨膜支架可以血管化，并促進骨缺損的修復(fù)，其血管化的關(guān)鍵因素可能是VEGF。此外，實驗中觀察到支架中血管密度呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，提示支架在完成修復(fù)功能后可能會發(fā)生降解，其機制有待進一步的研究和觀察。