靶向STAT3信號通路小分子抑制劑的設(shè)計、合成及其生物活性

何琴，張煥，杜旭澤，郭燾寧，葉發(fā)青

（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transduction and activators of transcription，STAT）蛋白家族是一類能將信號從細胞外傳導至細胞核內(nèi)，進而引起相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄的胞漿蛋白[1-3]。STAT3是STAT蛋白家族7個成員（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6）之一，能夠參與細胞增殖、分化和凋亡，調(diào)節(jié)血管生成等生物活動，具有多種重要的生物功能[4-7]。STAT3 的信號通路主要有表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號傳導通路、IL-6介導的JAK-STAT3途徑和SRC基因介導的信號傳導途徑。當細胞因子（如IL-6）或生長因子（如EGFR）等識別激活受體后，受體復合物募集STAT3，STAT3磷酸化、二聚化及核易位，與相應(yīng)靶基因結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達[2，8-9]。研究表明，在皮膚癌[10]、肺癌[11]等多種癌細胞中存在STAT3異常表達和持續(xù)激活的現(xiàn)象，但在正常組織細胞中STAT3瞬時激活，且受到嚴格調(diào)控[2，12]。此外，STAT3的過度激活還能產(chǎn)生免疫抑制作用，因此，阻斷STAT3的異?；罨粌H能抑制腫瘤細胞的惡性增殖，還可增強機體的免疫能力[13-14]。所以，STAT3作為研究抗腫瘤藥物的熱門靶點之一，受到廣泛的關(guān)注。

目前，STAT3抑制劑主要分為肽類、擬肽類及非肽類小分子抑制劑。雖然肽類和擬肽類STAT3抑制劑具有較高的活性，但存在透過細胞膜較困難，在體內(nèi)肽鍵容易代謝，生物利用度較低等問題，因此，STAT3小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)成為一大熱點[1-2，15-16]。但是市場上尚沒有經(jīng)FDA批準的用于癌癥臨床治療的STAT3小分子抑制劑。因此，開發(fā)活性較強，不良反應(yīng)小，安全性高，類藥性好的STAT3小分子抑制劑具有重要的意義。

STAT3小分子抑制劑S3I-V4-01是通過計算機模擬篩選獲得的[17-18]，對STAT3具有一定選擇性，能夠有效抑制STAT3的二聚化及磷酸化，對人乳腺癌細胞MDA-MB-231、胰腺癌細胞Panc-1及前列腺癌細胞DU145僅具有適度的抗增殖作用，IC50分別為（82.4±1.4）μmol/L、 （197.6±2.1）μmol/L和 （75.4±3.4）μmol/L。本研究通過對STAT3小分子抑制劑S3I-V4-01進行結(jié)構(gòu)修飾，以提高其對腫瘤細胞的抗增殖活性，設(shè)計思路如圖1所示，合成了2個系列化合物，分別為Z和H系列化合物，并初步探索了目標化合物的生物活性。

圖1 目標化合物Z系列及H系列

1 材料和方法

1.1 化學合成

1.1.1 儀器與試劑：若無特殊說明，普通化學試劑均為分析純，購自上海晶純化學品有限公司，無需進一步純化即可使用。薄層色譜硅膠板購自六安良臣硅源材料有限公司。柱層析硅膠采用青島海洋化工廠的薄層層析硅膠（200～300目）。UPLC-MS分析在Bruker Esquire HCT系統(tǒng)上測定。1H NMR和13C NMR實驗在25 ℃下用Bruker JEOL-AL-300FT核磁共振儀采集，以殘留溶劑峰作為內(nèi)標。

1.1.2 中間體Z1、H1的合成：將2-氨基-6-氯-9H-嘌呤（1 mmol）和相應(yīng)的酰氯（1.5 mmol）反應(yīng)，以吡啶（12 mL）為溶劑，用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）監(jiān)測反應(yīng)進程，常溫攪拌過夜。待原料反應(yīng)后，靜置，減壓抽濾，干燥濾渣并稱重，得到相應(yīng)的中間體[19]。

2-環(huán)己基酰胺-6-氯-9H-嘌呤（Z1）：白色固體，產(chǎn)率為82%；ESI-MS[M+H]+：280.1；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.988（s，1H，9-purine-H），9.989（s，1H，CONH），8.558（s，1H，8-purine-H），2.173-2.115（m，1H，cyclohexyl），7.400（m，10H，cyclohexyl）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：171.138，152.231，151.436，149.442，143.554，127.421，42.217，28.997，22.868.

2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-9H-嘌呤（H1）：白色固 體，產(chǎn)率為89%；ESI-MS[M+H]+：288.2；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.879（s，1H，9-purine-H），9.847（s，1H，CONH），8.644（s，1H，8-purine-H），8.423～8.356（m，2H，Ph-H），7.221～7.216（m，2H，Ph-H），2.331（s，3H，-CH3）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：166.004，152.115，151.428，149.538，143.883，138.012，134.101，128.330，124.441，21.217.

1.1.3 目標化合物Z2-Z5及H2-H5的合成：將2-環(huán)己基酰胺-6-氯-9H-嘌呤（Z1，1.0 mmol），2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-氯-9H-嘌呤（H1，1.0 mmol）分別與相應(yīng)的芐胺（1.5 mmol）反應(yīng)，以三乙胺（1.5 mmol）為催化劑，正丁醇（10 mL）為溶劑，120 ℃加熱回流 3 h，用TLC監(jiān)測反應(yīng)進程。待原料反應(yīng)后，冷卻靜置，減壓抽濾，并用正丁醇洗滌2次，干燥濾渣并稱重，得到相應(yīng)的產(chǎn)物[20]。

2-環(huán)己基酰胺-6-（3-甲氧基芐基）-9H-嘌呤（Z2）：白色固體，產(chǎn)率48.4%；ESI-MS[M+H]+：381.2；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.974（s，1H，9-purine-H），10.321（s，1H，CONH），9.687（s，1H，8-purine-H），7.214～7.188（m，1H，Ph-H），7.106～6.947（m，1H，Ph-H），6.803～6.769（m，1H，Ph-H），6.705～6.691（m，1H，Ph-H），4.663（d，J=3.000 Hz，2H，-CH2），3.720（s，3H，-OCH3），3.706（s，1H，-NH），2.382（s，1H，cyclohexyl），1.812～1.600（m，4H，cyclohexyl），1.383～1.322（m，4H，cyclohexyl），1.222～1.022（m，2H，cyclohexyl）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：170.124，168.127，158.268，156.263，155.005，139.516，139.234，135.234，129.452，128.511，115.416，114.331，44.983，43.567，29.785，28.567，27.456，26.786，20.251.

2-環(huán)己基酰胺-6-（2-甲氧基芐胺）-9H-嘌呤（Z3）：白色固體，產(chǎn)率53.4%；ESI-MS[M+H]+：381.3；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.984（s，1H，9-purine-H），9.580（s，1H，CONH），7.924（s，1H，8-purine-H），7.391～7.380（m，1H，Ph-H），7.300～7.274（m，1H，Ph-H），7.245～7.191（m，1H，Ph-H），7.166～7.140（m，1H，Ph-H），4.744（d，J=3.000 Hz，2H，-CH2），3.620（s，3H，-OCH3），3.606（s，1H，-NH），2.352（s，1H，cyclohexyl），1.764～1.744（m，4H，cyclohexyl），1.683～1.663（m，4H，cyclohexyl），1.612～1.597（m，2H，cyclohexyl）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：172.124，169.127，158.2134，157.263，156.005，139.346，139.454，135.267，129.432，128.531，115.445，114.321，44.945，43.567，29.756，28.437，27.456，20.231。

2-環(huán)己基酰胺-6-芐胺-9H-嘌呤（Z4）：白色固體，產(chǎn)率43.1%；ESI-MS[M+H]+：351.3；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.983（s，1H，9-purine-H），9.589（s，1H，CONH），7.759（s，1H，8-purine-H），7.462～7.424（m，2H，Ph-H），7.400（t，1H，J=5.400 Hz，Ph-H），7.392～7.322（m，2H，Ph-H），4.644（d，J=3.000 Hz，2H，-CH2），3.626（s，1H，-NH），2.362（s，1H，cyclohexyl），1.664～1.644（m，4H，cyclohexyl），1.653～1.643（m，4H，cyclohexyl），1.630～1.598（m，2H，cyclohexyl）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：171.124，169.135，158.219，157.573，156.009，139.365，139.497，135.287，129.457，128.558，115.475，114.576，44.967，43.538，29.756，28.447，27.456，26.466。

2-環(huán)己基酰胺-6-（2-氯芐胺）-9H-嘌呤（Z5）：白色固體，產(chǎn)率87.5%；ESI-MS[M+H]+：385.3；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.934（s，1H，9-purine-H），9.570（s，1H，CONH），7.934（s，1H，8-purine-H），7.730～7.632（m，1H，Ph-H），7.434～7.384（m，1H，Ph-H），7.271～7.242（m，1H，Ph-H），7.203～7.178（m，1H，Ph-H），4.744（d，J= 3.000 Hz，2H，-CH2），3.360（s，1H，-NH），2.346（s，1H，cyclohexyl），1.774～1.764（m，4H，cyclohexyl），1.684～1.673（m，4H，cyclohexyl），1.614～1.597（m，2H，cyclohexyl）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：171.124，169.157，158.214，157.263，156.005，139.346，139.454，135.267，129.432，129.531，115.445，114.321，44.945，29.756，28.437，26.466，20.231。

2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-（3-甲氧基芐胺）-9H-嘌呤（H2）：白色固體，產(chǎn)率44.2%；ESI-MS[M+H]+：389.4；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.985（s，1H，9-purine-H），9.621（s，1H，CONH），7.723（s，1H，8-purine-H），7.767～7.650（m，3H，Ph-H），7.347～7.340（m，1H，Ph-H），7.204～7.178（m，2H，Ph-H），7.017～6.953（m，1H，Ph-H），6.771～6.754（m，1H，Ph-H），4.630（d，J=2.400 Hz，2H，-CH2），4.510（s，3H，-OCH3），3.839（s，1H，-NH），2.366（s，3H，-CH3）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：168.365，166.367，156.237，154.243，154.051，139.546，139.456，135.146，129.847，128.343，119.567，115.446，44.963，19.552，10.324。

2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-（2-甲氧基芐胺）-9H-嘌呤（H3）：白色固體，產(chǎn)率43.4%；ESI-MS[M+H]+：389.2；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.885（s，1H，9-purine-H），10.202（s，1H，CONH），8.899（s，1H，8-purine-H），7.726～7.720（m，1H，Ph-H），7.523～7.445（m，1H，Ph-H），7.347～7.324（m，1H，Ph-H），7.263～7.211（m，1H，Ph-H），6.980～6.957（m，1H，Ph-H），6.873～6.849（m，1H，Ph-H），6.823～6.800（m，2H，Ph-H），4.375（d，J=2.400 Hz，2H，-CH2），3.824（s，3H，-OCH3），3.814（s，1H，-NH），2.355（s，3H，-CH3）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：168.375，166.335，156.262，154.256，154.151，139.546，139.456，135.146，130.847，128.343，119.567，116.446，44.963，19.552，12.324.

2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-芐胺-9H-嘌呤（H4）：白色固體，產(chǎn)率43.3%；ESI-MS[M+H]+：359.3；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：12.096（s，1H，9-purine-H），10.207（s，1H，CONH），8.115（s，1H，8-purine-H），7.747～7.704（m，1H，Ph-H），7.407～7.394（m，2H，Ph-H），7.360～7.351（m，3H，Ph-H），7.301～7.276（m，1H，Ph-H），7.218～7.193（m，2H，Ph-H），4.707（d，J=3.000 Hz，2H，-CH2），3.383（s，1H，-NH），2.356（s，3H，-CH3）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：169.134，167.235，156.245，155.236，154.041，139.536，137.414，135.146，129.838，128.365，119.487，115.356，44.963，19.552。

2-（3-甲基苯甲酰胺）-6-（2-氯芐胺）-9H-嘌呤（H5）：白色固體，產(chǎn)率46.3%；ESI-MS[M+H]+：393.2；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）:12.844（s，1H，9-purine-H），9.552（s，1H，CONH），8.560（s，1H，8-purine-H），7.962～7.605（m，2H，Ph-H），7.446～ 7.430（m，2H，Ph-H），7.374～7.359（m，2H，Ph-H），7.165～7.150（m，2H，Ph-H），5.319（d，J=2.400 Hz，2H，-CH2），3.337（t，J=6.000 Hz，1H，-NH），1.337（s，3H，-CH3）；13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：168.746，166.169，156.195，154.246，153.656，138.585，138.254，134.164，129.852，129.381，119.467，115.389，44.983，19.538。

1.2 生物活性研究

1.2.1 材料與儀器：人表皮鱗癌細胞A431、人非小細胞肺癌細胞A549購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、1%青霉素和鏈霉素、胎牛血清購于美國Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購自德國Roche公司；pSTAT3-Luc（Cat# LR0077）購自美國Panomics公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System購自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司。所用儀器主要有CO2培養(yǎng)箱、TGL-16G型臺式離心機購自上海醫(yī)療器械有限公司；正置、倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：A431細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，A549細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。當細胞融合到80%左右時可傳代。

1.2.3 熒光素酶報告基因法檢測p-STAT3實驗[21]：將細胞A431以每孔2×104個細胞的密度接種于96孔板中，并加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，使用之前報道的方法在接種后4 h進行瞬時轉(zhuǎn)染[21]。 每孔轉(zhuǎn)染的DNA（包括pSTAT3-Luc和內(nèi)部對照載體海腎）的量為0.5 μg。轉(zhuǎn)染6 h后，將成功轉(zhuǎn)染的細胞用10 μmol/L的S31-V4-01或待測目標化合物處理24 h，然后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒在酶標 儀上測定活性。相對熒光素酶活力單位（relative luciferase units，RLU）是螢火蟲熒光素酶的絕對活性與海腎熒光素酶的絕對活性的比值。進行3次獨立實驗以獲得平均值。

1.2.4 目標化合物對腫瘤細胞的抗增殖實驗：采用MTT法[22]對人表皮鱗癌細胞A431、人非小細胞肺癌細胞A549進行抗腫瘤細胞增殖實驗。體外培養(yǎng)A431、A549 細胞至對數(shù)生長期后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用適量培養(yǎng)基懸浮，將細胞懸液接種到96 孔細胞培養(yǎng)板中，使細胞為8×103個/孔，并放置細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入用DMSO溶解的終濃度為10 μmol/L的各待測化合物，每個化合物設(shè)6個復孔。設(shè)1組陽性對照孔，2組陰性對照孔。給藥48 h后，每孔中加入20 μL用PBS配制的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)4 h。從培養(yǎng)箱中移出96孔板，棄去孔中的溶液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，并于搖床上搖勻10 min；最后在酶標儀上檢測紫外吸收波長在490 m處的吸光值，根據(jù)公式計算出相應(yīng)的細胞抑制率。本實驗進行至少重復3次以減少實驗誤差。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 目標化合物的合成 本研究共8個目標化合物的合成路線及結(jié)構(gòu)如圖2所示，以2-氨基-6-氯-9H-嘌呤為起始原料，分別與環(huán)己酰氯、3-甲基苯甲酰氯反應(yīng)，吡啶為溶劑，室溫下攪拌過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，靜置抽濾，干燥濾渣，得中間體Z1、H1；Z1、H1以三乙胺為縛酸劑，正丁醇為溶劑，與相應(yīng)芐胺在加熱回流條件下反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻靜置，將正丁醇減壓抽濾，并用正丁醇洗滌2次，干燥濾渣，得目標產(chǎn)物。

2.2 目標化合物對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響 利用熒光素酶報告基因法檢測化合物對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響。在用pSTAT3-Luc載體瞬時轉(zhuǎn)染后，測定A431細胞中的STAT3啟動子活性。目標化合物對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的活性結(jié)果如圖3所示，用 10 μmol/L目標化合物和陽性對照S3I-V4-01處理后，能抑制A431細胞中的STAT3啟動子活性，其中化合物H2、H4與S3I-V4-01的效果相當，化合物H3的抑制程度較S3I-V4-01更強，其抑制率約為58%。

圖2 目標化合物Z2-5、H2-5的合成路線及結(jié)構(gòu)

圖3 目標化合物對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響

2.3 目標化合物對腫瘤細胞增殖的影響 人表皮鱗癌細胞A431[23]、人非小細胞肺癌細胞A549[24]中存在STAT3過度激活的情況，因此本實驗選擇在這2種細胞系上檢測目標化合物對腫瘤細胞增殖的影響。在人表皮鱗癌細胞A431中，大部分目標化合物的抑制率超過50%，其中有3個目標化合物的抑制率與陽性對照S3I-V4-01相當，分別為Z3、Z4及H4；化合物H2和H3的抑制效果優(yōu)于S3I-V4-01；H系列化合物的抗增殖作用總體比Z系列強（見圖4A）。在人非小細胞肺癌細胞A549中，大部分目標化合物的抑制效果較差，但是化合物H3的抑制率仍略高于陽性對照S3I-V4-01，且對A431細胞也有較理想的抑制作用（見圖4B）。通過對A431細胞抗增殖作用的初步構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)：①分別比較化合物Z4與Z5，H4與H5，氯原子的引入不會明顯改善化合物的抗增殖作用；②芐基苯環(huán)上的鄰位取代比間位取代的抗增殖效果更佳，如化合物Z2與Z3，H2與H3；③嘌呤6位氨基上的間甲基苯環(huán)取代化合物抑制細胞增殖作用比環(huán)己烷取代化合物強，如Z5和H5。

3 討論

STAT3是EGFR、IL-6/JAK及SRC等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路的匯聚焦點，在多種腫瘤組織和器官中都過表達[25-26]。STAT3的持續(xù)激活是腫瘤形成和發(fā)展所必需的，STAT3的異常磷酸化不僅能破壞機體的正常免疫功能，增強腫瘤的免疫逃逸能力，還可以阻礙正常的炎癥反應(yīng)，從而形成利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的腫瘤微環(huán)境[27]，因此，STAT3小分子抑制劑的研究對于腫瘤治療具有重要意義。

圖4 目標化合物抑制腫瘤細胞增殖作用

本研究對已報道的STAT3 小分子抑制劑S3IV4-01進行結(jié)構(gòu)改造，合成了Z系列和H系列兩類共8個目標化合物，并在體外對其進行初步的生物活性探索實驗。為驗證目標化合物是否為STAT3靶向抑制劑，運用熒光素酶報告基因法檢測其對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響，結(jié)果表明在10 μmol/L濃度下，化合物H2、H4與S3I-V4-01的效果相當，化合物H3抑制作用最強且優(yōu)于S3I-V4-01。由于腫瘤細胞的增殖能力在腫瘤研究過程中至關(guān)重要，本研究采用MTT實驗檢測目標化合物對STAT3過表達的腫瘤細胞A431和A549的抗增殖能力，結(jié)果表明目標化合物對A431細胞的抑制作用比A549更佳，化合物H4抗腫瘤細胞增殖能力與S3I-V4-01相當，化合物H3對A431和A549的抑制效果最優(yōu)均強于陽性對照S3I-V4-01。最佳化合物H3對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的阻滯效果最優(yōu)，抗細胞增殖作用最強，化合物抗腫瘤活性的趨勢和對STAT3抑制相一致，說明化合物的靶向選擇性較好。

綜上所述，通過對STAT3小分子抑制劑S3I-V4- 01的合理改造，合成并篩選出了抗腫瘤細胞增殖活性更強，且能阻斷STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的化合物H3，后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾可在H3上進行以提高抗腫瘤活性。