解耦聯(lián)蛋白3基因-55C/T多態(tài)性與2型糖尿病血糖控制的相關性

周 晶,鄭 銀,2,段英連,王曉成,邵晉康,楊艷蘭,秦 潔,馬嬋娟,4*

(1山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,太原 030012;2天津醫(yī)科大學內(nèi)分泌研究所;3山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院病案統(tǒng)計科;4山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:mcj5670206@163.com)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以慢性高血糖為特征的一類慢性代謝性疾病,存在胰島素分泌和/或胰島素作用的缺陷。其由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起[1]。由于糖尿病的發(fā)病存在由多基因介入與機體環(huán)境因素交互作用產(chǎn)生的異質性,因此對遺傳相關基因的研究成為熱點。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)多個基因多態(tài)性位點與T2DM密切相關[2,3]。解耦聯(lián)蛋白3(uncoupling protein 3,UCP3)是主要在骨骼肌表達的線粒體陰離子轉運蛋白,它可以通過使氧化磷酸化解耦聯(lián)減少ATP和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成[4],也可以通過轉運脂肪酸陰離子/轉運非酯化脂肪酸出線粒體內(nèi)膜減少脂質過氧化損傷作用并參與脂肪酸代謝[5,6]。骨骼肌是體內(nèi)胰島素刺激的葡萄糖利用的主要場所,占全身葡萄糖利用的75%,故骨骼肌是重要的外周胰島素抵抗器官,作為目前已知的在骨骼肌唯一表達的解耦聯(lián)蛋白,UCP3在能量代謝及糖代謝中的作用近年來備受關注。UCP3基因定位于染色體11q13,長8.7 kb。UCP3基因啟動子區(qū)-55 bp處、即TATA盒上游6 bp處存在C→T的變異[7]。國內(nèi)外有多項研究報道該多態(tài)性與體脂代謝、肥胖及2型糖尿病發(fā)病的相關性,但是,由于各項研究中受試人群的種族、性別及樣本量存在差異,因此報道的結果不盡相同[8-15]。且較少有研究關注UCP3基因多態(tài)性與2型糖尿病血糖控制水平的相關性。因此,本研究以我國北方漢族T2DM患者及健康對照人群為研究對象,探討UCP3-55C/T多態(tài)性與T2DM患者血糖控制水平的相關性。

1 對象及方法

1.1 對象

選取2018-03～2018-07入我院就診的T2DM患者(T2DM組)103例,男60例,女43例,平均年齡(59.23±11.24)歲,病程1月-27年。選取同期于我院體檢中心體檢的非T2DM對照組(NC組)110例,男52例,女58例,平均年齡(52.27±10.51)歲,受試者間無親緣關系。T2DM診斷依據(jù)1999年WHO制定的診斷標準:糖尿病癥狀+隨機血糖≥11.1 mmol/L或空腹血漿葡萄糖(FBG)≥7.0 mmol/L和(或)口服糖耐量實驗(OGTT)2 h血糖≥11.1 mmol/L。糖尿病癥狀包括:多尿、多飲、多食、體質量明顯下降。根據(jù)病史、家族史除外1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及遺傳性缺陷導致的糖尿病。排除急性感染、應激狀態(tài)及嚴重肝腎損害及心功能不全。該項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有受試者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 人體測量學指標的測量 清晨空腹狀態(tài)下,排空大小便,脫鞋并去外衣,測身高、體質量、腰圍,并測量血壓(收縮壓SBP,舒張壓DBP),計算BMI。BMI=體質量(kg)/身高的平方(m2)。腰圍的測量即繞臍水平一周的長度。

1.2.2 生化指標及血清胰島素檢測 研究對象隔夜禁食12 h,于次日清晨抽取空腹靜脈血,測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)及血脂。采用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖,甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)采用酶法測定,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用硫酸葡聚糖-錳沉淀法及公式計算。利用高效液相離子層析法檢測HbA1c?；瘜W發(fā)光法測定FINS,試劑盒購于美國貝克曼公司。采用穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)評價受試者的胰島素抵抗程度(HOMA-IR=空腹胰島素×空腹血糖/22.5)。

1.2.3 血清脂聯(lián)素(adiponectin)的測定 研究對象均隔夜禁食12 h,于次日清晨抽取空腹靜脈血約3 ml,離心并分離血清,冷藏于-80 ℃待測脂聯(lián)素。采用ELISA方法測定,試劑盒購自美國R&D SYSTEMS公司。

1.2.4 UCP3-55C/T基因型測定 ①DNA的提取:采用常規(guī)酚/氯仿法提取DNA(全血DNA提取試劑盒由美國Omega Bio-Tek公司提供)。②基因型測定:采用聚合酶鏈反應-直接測序法測定。具體步驟如下:以100 ng DNA為模板在總反應體系30 μl行PCR擴增,上游引物為5′-TCTCTGAAAGCCTCCAA-3′,下游引物5′-GTGCCCAGCCTATCGTG-3′(由北京六合華大基因科技有限公司合成),其中10×PCR緩沖液3 μl,dNTP Mixture 4 μl,上下游引物各1 μl,Ex Taq酶1 μl;PCR反應條件:96 ℃預變性5 min,96 ℃變性20 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共進行35個循環(huán),末次循環(huán)后72 ℃延伸5 min至4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化:按照Millipore公司96純化板操作流程操作:向96孔純化板中加入100 μl ddH2O,取出PCR產(chǎn)物至96純化板中室溫靜置10 min,真空抽濾泵抽10 min至抽干,向96孔純化板中加入40 μl ddH2O,室溫溶解10 min,取出對應的孔中的純化產(chǎn)物至另一96孔PCR板中。PCR產(chǎn)物測序:測序反應體系為:2 μl Mix(Bigdye3.1、5×測序緩沖液、H2O),2 μl純化后的PCR產(chǎn)物,1 μl引物(5 mmol/L)。循環(huán)條件及反應程序為:95 ℃ 15 s→(95 ℃ 15 s →50 ℃ 5 s→60 ℃ 90 s)×35個循環(huán)→終止反應(72 ℃ 5 min)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組一般資料及代謝性指標比較

T2DM組的年齡、FBG、HbA1c、SBP、DBP明顯高于NC組,HDL-C低于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見表1)。

2.2 兩組UCP3-55C/T基因型及等位基因頻率比較

經(jīng)檢驗,UCP3-55C/T基因型頻率在各組分布符合Hardy-Weinberg平衡,數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體,具有較好的群體代表性(NC組:χ2=0.227,P=0.633;T2DM組:χ2=0.211,P=0.646)。T2DM組與NC組的基因型頻率和等位基因頻率分布見表2。NC組基因型頻率:CC、CT、TT分別為38.18%,45.45%,16.36%;等位基因頻率:C為60.91%,T為39.09%。T2DM組基因型頻率:CC、CT、TT分別為42.71%，43.69%，13.59%；等位基因頻率:C為64.56%，T為35.44%。兩組間三種基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，見表2)。

表1 兩組臨床資料及生化指標比較

Table 1 Comparison of clinical data and biochemical indexes between two groups

項目NC組T2DM組 t/χ2 P男/女52/5860/43 2.437 0.307年齡(歲)52.27±10.5159.23±11.24-4.67<0.001BMI(kg/m2)24.49±2.99 24.96±3.16 -1.130.258腰圍(cm)87.17±7.46 88.68±11.04-1.1610.247TG(mmol/L)1.68±0.871.81±1.69-0.6770.500TC(mmol/L)4.40±1.064.42±1.20-0.1330.895LDL-C(mmol/L)2.55±0.532.72±0.80-1.8160.071HDL-C(mmol/L)1.13±0.221.06±0.252.1370.034FBG(mmol/L)4.94±0.407.82±2.99-9.470<0.001HbA1c(%)5.11±0.398.59±2.07-16.786<0.001HOMA-IR3.68±2.844.22±2.97-1.3380.182SBP(mmHg)121.45±13.05 128.30±10.96 -4.082<0.001DBP(mmHg)74.85±9.62 77.35±7.10 -2.1170.036

表2 兩組UCP3-55 C/T基因型及等位基因頻率分布例(%)

Table 2 Distribution of UCP3-55 C/T genotype and allele frequency in two groupscases(%)

組別n基因型CCCTTTχ2P等位基因CTχ2P NC11042(38.18)50(45.45)18(16.36)0.580.748134(60.91)86(39.09)0.6070.436 T2DM10344(42.71)45(43.69)14(13.59)133(64.56)73(35.44)

2.3 T2DM組與NC組各組不同基因型臨床資料比較

按UCP3-55 CC、CT、TT將NC組與T2DM組各分為三個亞組,在NC組中,各亞組BMI、LDL-C差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),TT基因型患者的BMI顯著低于CC基因型患者(P<0.001),而LDL-C在TT基因型患者中高于CC基因型患者(P<0.001)。2型糖尿病組中,各亞組患者病程及用藥無明顯差異。各亞組LDL-C差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中TT基因型患者的LDL-C高于CC基因型患者。在T2DM組及NC組中,與CC基因型者相比,TT基因型患者的HbA1c有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(見表3)。

2.4 UCP3-55C/T基因型及等位基因在不同HbA1C分組中的分布

進一步將T2DM患者按照糖化血紅蛋白水平分為3個亞組(<7%,7%-9%,≥9%),比較各亞組基因型及等位基因的分布頻率。三亞組間三種基因型頻率分布有統(tǒng)計學意義(P=0.024),TT基因型在HbA1C≥9%的患者中所占比例明顯低于CC基因型,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.043)。等位基因T在HbA1C≥9%的患者中所占比例低于等位基因C(P=0.057,見表4)。

2.5 血清脂聯(lián)素與UCP3-55C/T基因型之間的關系

本研究進一步檢測了T2DM患者的血清脂聯(lián)素

表3 各組不同基因型臨床資料比較

Table 3 Comparison of clinical data among different genotypes in two groups

項目NC組T2DM組CCCTTTCCCTTT BMI(kg/m2)25.79±2.99 24.11±2.95 22.49±1.40??##24.63±3.18 24.99±3.16 25.89±3.07 腰圍(cm)87.12±7.66 87.20±7.67 87.22±6.78 87.80±10.7787.86±11.4194.11±9.79 TG(mmol/L)1.66±0.891.60±0.841.93±0.922.07±2.291.71±1.771.35±0.54 TC(mmol/L)4.32±0.944.42±1.034.51±1.414.51±1.254.14±1.075.01±1.29 LDL-C(mmol/L)2.33±0.362.60±0.65 2.88±0.25??##2.74±0.772.56±0.75 3.17±0.92? HDL-C(mmol/L)1.15±0.241.15±0.211.07±0.171.10±0.281.00±0.211.17±0.21 FBG(mmol/L)4.93±0.414.92±0.404.99±0.398.46±3.557.53±2.616.68±1.46 HbA1c(%)5.05±0.335.13±0.384.97±0.348.56±2.118.89±1.957.69±2.16 HOMA-IR3.85±2.233.30±3.194.35±3.024.16±2.614.25±3.524.36±2.29 SBP(mmHg)121.45±14.66 121.32±11.25 121.86±14.51 128.02±11.54 127.89±11.47 130.50±7.12 DBP(mmHg)75.17±10.7774.32±8.38 75.71±10.5078.68±7.14 76.18±7.47 76.93±5.20 病程(年)---10.00(3.00,18.75)12.00(3.00,20.00)10.00(7.50,14.00)

同組內(nèi)與CC及CT型比較，*P<0.05，**P<0.001;與CC組比較,##P<0.001

表4 UCP3-55C/T基因型及等位基因在不同HbA1C分組中的分布例(%)

Table 4 Distribution of UCP3-55C/T genotype and allele frequency in different HbA1c groupscases(%)

UCP3-55C/THbA1c<7%7%-9%≥9%χ2P 基因型11.2170.024 CC15(55.56)9(27.27)20(46.51) CT7(25.93)17(51.52)21(48.84) TT5(18.52)7(21.21)2(4.65)6.282?0.043? 等位基因5.730.057 C37(65.8)35(53.0)61(70.9) T17(31.5)31(47.0)25(29.1)

*表示與CC組比較

水平,在CC、CT、TT各基因型中脂聯(lián)素水平分別為:2 952.10(1 784.40,4 923.40)pg/ml,3 520.30(2 699.30,6 682.10)pg/ml，5 136.10(2 814.38,13 347.83)pg/ml,攜帶T等位基因(CT+TT)的患者血清脂聯(lián)素水平高于CC基因型患者。行Spearman秩相關,結果顯示UCP3-55C/T基因型與患者脂聯(lián)素水平呈正相關(r=0.256,P=0.026),TT基因型患者血清脂聯(lián)素水平明顯升高。

3 討論

UCP3是解耦聯(lián)蛋白超家族的成員之一,該家族是一類位于線粒體內(nèi)膜上的質子轉運蛋白。UCP作為線粒體內(nèi)膜的質子載體,能將線粒體內(nèi)膜外側的H+運回內(nèi)側,降低在物質氧化過程中H+形成的膜兩側的電化學梯度,從而將線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞過程和ATP的合成過程解耦聯(lián),使內(nèi)膜上的電能以熱能的形式釋放,導致能量消耗和產(chǎn)熱增多。哺乳動物體內(nèi)已知的UCPs包括UCP1-5。UCPs的共同特征是其單體由大約300個氨基酸組成,每個單體均具有6個穿膜結構域,UCPs只有二聚體才有轉運功能,UCPs家族每個成員均有3個由100個氨基酸組成的重復序列。UCP1是最早發(fā)現(xiàn)的解耦聯(lián)蛋白,它僅分布在棕色脂肪中,其主要功能是產(chǎn)熱。UCP2對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及胰島β細胞的功能具有重要的作用。UCP3是UCPs中唯一在骨骼肌線粒體內(nèi)表達的蛋白質,它主要在骨骼肌表達,在棕色脂肪組織和心肌中也有少量分布[16]。骨骼肌的能量代謝是人體基礎代謝率的主要決定因素,UCP3在骨骼肌特異性表達可能對人體的能量消耗具有非常重要的意義。UCP3基因啟動子區(qū)-55 bp處存在C→T變異,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)UCP3基因的遺傳多態(tài)性與代謝、肥胖相關表型變化及T2DM發(fā)病有著不同程度的關聯(lián)性。目前對UCP3-55C/T基因多態(tài)性與肥胖及T2DM發(fā)病的相關性研究結果不盡一致,有的研究認為T基因攜帶者與C基因攜帶者相比BMI更低,T2DM的發(fā)病風險低[9,10,13,14],有的研究則發(fā)現(xiàn)TT基因型受試者的BMI高于CC及CT基因型[8],而有的研究則認為該多態(tài)性位點與體質量無明顯相關[8,12]。我國上海地區(qū)的研究顯示UCP3-55C/T基因多態(tài)性與肥胖不相關,但TT基因型者具有更高的靜息代謝率[17]?？傊?目前國內(nèi)外對UCP3-55C/T基因多態(tài)性與肥胖、T2DM的相關性尚無定論,且以往國內(nèi)外研究關注的均為UCP3基因多態(tài)性與肥胖或T2DM發(fā)病風險的相關性,較少關注UCP3基因多態(tài)性與T2DM血糖控制水平的相關性。因此本研究通過觀察T2DM患者及健康對照人群中UCP3-55C/T不同基因型空腹血糖及糖化血紅蛋白水平,探討UCP3-55C/T多態(tài)性與T2DM患者血糖控制水平的相關性。

研究表明,在Pima印第安人中,攜帶55T等位基因的受試者骨骼肌UCP3 mRNA表達高于攜帶C等位基因者[7]。研究發(fā)現(xiàn),過表達UCP3的小鼠,空腹血糖和胰島素水平降低,糖耐量增加[18]。對60倍過表達UCP3的小鼠研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食后,UCP3可通過促進脂肪酸代謝,降低膜與胞質二脂酰甘油的比例,PKCθ激活減少,IRS-1絲氨酸磷酸化水平降低,酪氨酸磷酸化水平增加,胰島素信號通路增強,從而保護機體不發(fā)生高脂誘導的胰島素抵抗[15]。特異性在酵解型骨骼肌2倍過表達UCP3的雌性小鼠經(jīng)過14周高脂飲食后,其胰島素敏感性高于對照小鼠[19,20]。UCP3可促進骨骼肌細胞GLUT4轉位,促進葡萄糖攝取[21]。我們的研究結果顯示在健康對照及T2DM患者中,TT基因型者的糖化血紅蛋白較CC基因型者低;將T2DM患者根據(jù)糖化血紅蛋白水平分組后,發(fā)現(xiàn)在糖化血紅蛋白大于9.0%的患者中TT基因型所占的比例降低。因此我們推測TT基因型的患者骨骼肌UCP3表達量增加,骨骼肌葡萄糖攝取增加,從而使血糖水平下降。但我們的結果顯示,在T2DM組中,TT基因型患者空腹血糖較CC基因型患者低,但差異無統(tǒng)計學意義。在健康對照組中,各基因型的空腹血糖未見明顯差異。故我們猜測TT基因型患者糖化血紅蛋白的降低可能主要是由于骨骼肌UCP3表達量增加,促使骨骼肌葡萄糖攝取增加,從而使餐后血糖下降所致。遺憾的是,本次研究未能完善葡萄糖耐量試驗,缺乏餐后血糖的數(shù)據(jù),且HOMA-IR在各組間未見明顯差異,這與我們設想TT基因型胰島素敏感性增加不符,分析原因可能如下:高胰島素正葡萄糖鉗夾技術是測定IR的“金標準”,但因其操作復雜、費用昂貴,難以推廣。隨后有學者們提出了多種評價IR的簡易公式計算方法,HOMA-IR即為其中之一[22-23]。HOMA-IR的計算基礎是單次檢測的FBG及FINS值,而單次測定的值容易受多種因素影響,如檢測方法的不同、患者體質量差異等。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn),HOMA-IR在NGT和IGT組中均展現(xiàn)了與鉗夾技術中GIR的明顯相關性,但在DM組中相關關系缺失[24],說明用HOMA-IR評價T2DM患者的胰島素抵抗程度存在一定的欠缺。且HOMA-IR僅考慮了空腹血糖及空腹胰島素,主要代表了肝臟的胰島素敏感性[25-26],而解耦聯(lián)蛋白3主要表達在骨骼肌,我們推測UCP3主要通過增加骨骼肌的葡萄糖攝取改善胰島素敏感性降低血糖,這可能是我們的研究結果未發(fā)現(xiàn)不同基因型的HOMA-IR有差異的原因。且我們的研究樣本量較少可能對結果也有一定的影響。我們將在今后的實驗中擴大樣本量、完善葡萄糖耐量試驗,進一步探討UCP3-55C/T基因多態(tài)性與餐后血糖的相關性,明確UCP3-55C/T基因多態(tài)性與T2DM患者血糖控制水平的關系。

脂聯(lián)素是一種由脂肪組織特異性分泌的細胞因子,它可以通過激活AMPK促進外周組織葡萄糖攝取,改善胰島素敏感性[27,28]。我們的研究結果顯示攜帶T等位基因(CT+TT)的患者血清脂聯(lián)素水平高于CC基因型患者,Spearman秩相關結果顯示UCP3-55C/T基因型與患者脂聯(lián)素水平呈正相關,TT基因型患者血清脂聯(lián)素水平明顯升高。提示T等位基因攜帶者可通過增加血清脂聯(lián)素的表達改善胰島素抵抗進而改善糖尿病患者的血糖控制水平,但具體機制還有待于進一步研究。

本研究結果顯示,在NC組攜帶T等位基因者BMI低于攜帶C等位基因者,但在T2DM組三種不同基因型的患者體質量未見明顯差異,這與先前的研究一致[11],可能T等位基因在不同人群中對BMI的影響不同。在NC和T2DM組,我們均觀察到TT基因型患者LDL-C升高,這與先前的研究一致[10]。推測機制可能為:UCP3是過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)的作用靶點,UCP3-55C/T位于UCP3基因PPAR反應元件下游4 bp,故推測該基因多態(tài)性會影響UCP3基因對PPAR的反應,從而影響脂代謝。

綜上所述,與CC基因型患者相比,TT基因型患者HbA1c有下降趨勢。在血糖控制不佳的T2DM患者中,TT基因型占比明顯降低,提示TT基因型可能與T2DM患者的血糖控制水平相關,但其具體機制有待進一步闡明。