水解CaCO3作為交聯(lián)劑制備羧甲基殼聚糖凝膠微球

闞廣乾，秦榮基,蓋文龍，江曉澤，孫 賓*

(1.東華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620;2.山東陸海藍圣生物科技股份有限公司，山東 東營 257500)

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl Chitosan，簡稱CMCS，下同)是殼聚糖的羧基化取代產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖形成的陽離子共聚物，具體如圖1所示。CMCS具有良好的生物再生性、生物可降解性、生物穩(wěn)定性、生物粘附性和無毒等特點，常溫下在水溶液中的溶解量最大可達10%質(zhì)量分數(shù)以上[2]。多糖類凝膠微球的研究歷史悠久，Bodmeier等人早在1997年就報道使用殼聚糖和三聚磷酸鹽反應(yīng)制備納米微球，殼聚糖分子鏈的氨基和TPP發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米微球結(jié)構(gòu)[3]。Shi等人制備了一種由羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉和膠原復(fù)合微球組成的粉狀止血劑，在石蠟油和羧甲基殼聚糖水溶液混合，在乳液環(huán)境下使用氯化鈣作為離子交聯(lián)劑制備微球[4]。Li等人使用吐溫80和乳化劑司班-80/吐溫-80為乳化劑，采用反相乳液法，以大豆油為油相，氯化鈣為交聯(lián)劑制得海藻酸鈉/殼聚糖納米微球[5]。銀單質(zhì)的抗菌性能自古代就廣泛使用，納米材料因其尺寸大小而具有特定的量子效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)使其表面效應(yīng)十分明顯，相比于傳統(tǒng)的純銀單質(zhì)固體，納米級銀單質(zhì)具有更好的的抗菌效果[6-8]，以生物多糖為載體，制備含銀的多糖微球粉末，可用于止血和抗菌材料使用。

凝膠微球的制備采用反相乳液聚合體系，向油相分散相體系中逐滴滴入羧甲基殼聚糖的水溶液，分別使用GDL/碳酸鈣和檸檬酸/碳酸鈣作為交聯(lián)體系。通過在溶液中加入硝酸銀溶液，使用檸檬酸作為交聯(lián)劑同時作為銀的還原劑，一步法直接制備含銀的羧甲基殼聚糖微球粉末，對粉末的銀單質(zhì)和粉末整體的各項其他性能進行表征和測試。

圖1 N,O-型羧甲基殼聚糖結(jié)構(gòu)

1 實驗部分

1.1 實驗原料與試劑

表1 實驗原料與試劑

表1(續(xù))

1.2 羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠微球制備

1.2.1 GDL/碳酸鈣/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠微球的制備

1)稱取1 g羧甲基殼聚糖置于100 mL燒杯中，加入24 mL DI-Water充分溶解，制備成質(zhì)量分數(shù)4%的羧甲基殼聚糖溶液，500 r/min下攪拌24 h，真空下脫泡并抽濾；

2)向250 mL三口燒瓶中加入150 mL石蠟油，分別加入2.0 g swan-80和2.0 g tween-80作為乳化劑，加入0.6 g硬脂酸鎂促進乳化液的形成，加入0.15 g納米碳酸鈣，機械攪拌2 h混合均勻，轉(zhuǎn)速500 r/min，溫度60℃；

3)向體系中加入0.12 g 碳酸鈣，攪拌2 h；

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4)使用5 mL注射器抽取4%的羧甲基殼聚糖溶液，逐滴加入羧甲基殼聚糖溶液形成油包水體系；

5)稱取0.54 g GDL，于10 mL水中充分溶解，使用滴管緩慢加入三口燒瓶中，攪拌下反應(yīng)2 h；

6)將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取下層乳白色混合液，3000 r/min下離心1 min；

7)取離心下層固體用石油醚/乙醇分別沖洗三次并再離心，產(chǎn)物減壓抽濾除去多余的碳酸鈣，40℃下真空干燥。

1.2.2 檸檬酸/碳酸鈣/羧甲基殼聚糖微球的制備

1)步驟1-4同1.2.1；

5)稱取0.2 g一水檸檬酸，于5 mL水中充分溶解，使用滴管緩慢加入三口燒瓶中，調(diào)節(jié)溫度至95℃，反應(yīng)2 h；

6)將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取下層乳白色混合液，3000 r/min下離心1 min；

7)取離心下層固體用石油醚/乙醇分別沖洗三次并再離心，產(chǎn)物減壓抽濾除去多余的碳酸鈣，40℃下真空干燥。

1.2.3 檸檬酸/碳酸鈣/AgNPs/羧甲基殼聚糖微球的制備

1)同1.2.1的步驟1、2、3;

4)稱取0.1 g AgNO3，溶解于5 mL水中，使用滴管緩慢加入三口燒瓶中；

5)稱取0.25 g一水檸檬酸，于5 mL水中充分溶解，使用滴管緩慢加入三口燒瓶中，調(diào)節(jié)溫度至95℃，反應(yīng)2 h；

6)將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取下層淺黃色混合液，3000 r/min下離心1 min；

7)取離心下層固體用石油醚/乙醇分別沖洗三次并再離心，產(chǎn)物減壓抽濾除去多余的碳酸鈣，40℃下真空干燥。

圖2 凝膠微球的制備過程

Fig.2 Gelation process of CMCS microspheres

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收

將粉末樣品分散于乙醇溶液中，均勻涂覆在載玻片上，待其自然干燥后粉末粘附在載玻片上，使用固體紫外-可見光分光光度計測試粉末的紫外吸收，設(shè)置掃描波長250～750 nm，掃描次數(shù)為3次疊加，結(jié)果如圖3所示。

從圖3看出，將使用檸檬酸交聯(lián)還原的檸檬酸/碳酸鈣/AgNPs/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠微球與水溶性納米銀膠束作對比，在固體紫外下，復(fù)合凝膠微球的吸收峰峰值出現(xiàn)445 nm處，相比于水溶性銀膠束的420 nm略有紅移，且峰更寬。說明檸檬酸還原下的銀粒徑尺寸為納米級，尺寸應(yīng)該在20 nm以上，且其還原的納米銀尺寸均一性比水溶性納米銀膠束略差。

圖3 水溶性納米銀與含銀羧甲基殼聚糖微球的固體紫外

2.2 紅外分析

將粉末樣品在40℃下干燥除去水分，使用ATR-FT-IR測試紅外吸收，波長設(shè)置為750～3500，掃描次數(shù)為32次。結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同凝膠微球的紅外

從圖4看出，GDL/碳酸鈣/羧甲基殼聚糖凝膠微球形成雙重交聯(lián)結(jié)構(gòu)，在未交聯(lián)的CMCS原料的譜圖中，644～934 cm-1處為羧甲基殼聚糖雜環(huán)的振動峰，在GDL交聯(lián)反應(yīng)后，溶解作用使羧甲基殼聚糖1637 cm-1處由自身氫鍵作用產(chǎn)生的峰消失，GDL與羧甲基殼聚糖端羧基形成酯鍵結(jié)構(gòu)，形成1025 cm-1處的酯鍵峰，1536 cm-1處-NH2移動至1554 cm-1處，由游離胺基結(jié)構(gòu)變成酰胺鍵II譜帶結(jié)構(gòu)；圖中1402 cm-1處峰為離子態(tài)羧甲基和Ca2+的峰[9]。對比檸檬酸交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，900 cm-1以下的雜環(huán)面內(nèi)面外的振動峰屬于羧甲基殼聚糖碳雜環(huán)，1368 cm-1，2851 cm-1，2912 cm-1處為檸檬酸碳環(huán)結(jié)構(gòu)上C6的面內(nèi)彎曲和伸縮振動峰，1589 cm-1處為形成的羧酸酯的峰，檸檬酸與羧甲基殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成[10]。

2.3 粒度分析

將未分離的離心產(chǎn)物重新溶解分散于100 mL水中稀釋，抽取10 mL于100 mL容量瓶中并定容，在常溫下，使用納米粒度與電位儀分析其粒徑分布，測試時選用塑料皿，條件為水。

從圖5的粒徑分布來看，二者均處在微米級，其中，GDL/CaCO3體系的微球粒徑在1.8 μm左右，而檸檬酸交聯(lián)微球的粒徑在2 μm以上。從分散性上來看，GDL原位釋放鈣離子的方法獲得凝膠微球的粒徑均勻性更好。

1.GDL/碳酸鈣/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠微球；2.檸檬酸/碳酸鈣/羧甲基殼聚糖復(fù)合凝膠微球

圖5 粒徑分布

Fig.5 Particle size distribution

2.4 熱重分析

圖6 不同凝膠微球的熱失重

通過分析樣品的熱失重情況，可以看出不同樣品的熱穩(wěn)定性的區(qū)別，熱失重的測試前，將樣品在40℃下真空干燥24 h，除去粉末的自由水。將樣品在N2氛圍下升溫到900℃，觀察樣品的熱失重情況。如圖6所示。

從圖6對比三種羧甲基殼聚糖凝膠微球的熱失重情況來看，三條曲線的趨勢接近，曲線中，200℃之前的略微下降為結(jié)合水的失去，溫度200℃之后出現(xiàn)熱失重，此為多糖分子鏈開始斷裂時的溫度，隨著溫度的繼續(xù)升高，當溫度到700℃時，多糖分子開始分解。GDL/CaCO3體系交聯(lián)微球的熱穩(wěn)定性比檸檬酸交聯(lián)的更好，對比CA/CaCO3/CMCS和CA/CaCO3/AgNPs/CMCS微球，硝酸銀的加入和還原成單質(zhì)銀，也略微提高了微球的熱穩(wěn)定性。

2.5 結(jié)晶性能

干燥后的產(chǎn)物使用一維X射線衍射儀分析其結(jié)晶情況，測試時2θ選5～60°，并計算粉末的總結(jié)晶度。如圖7所示。

從圖7對比純CMCS和GDL/碳酸鈣交聯(lián)的羧甲基殼聚糖，溶解再成型的過程破壞了羧甲基殼聚糖內(nèi)部的氫鍵結(jié)構(gòu)，也使其峰形更加尖銳突出。由于GDL緩慢水解過程消耗掉了全部的碳酸鈣，圖中不再觀察到在30°左右處的隸屬于碳酸鈣的結(jié)晶峰。對比CA/CaCO3/CMCS與純碳酸鈣，為了能夠順利分離微球，所使用的納米碳酸鈣相對過量，因此檸檬酸法制備的含碳酸鈣凝膠微球中保留著部分碳酸鈣的結(jié)晶峰，碳酸鈣沒有完全溶解，殘留在微球粉末中。

圖7 不同凝膠微球的XRD圖譜

3 總結(jié)

分別使用GDL/碳酸鈣和檸檬酸/碳酸鈣復(fù)合體系作為交聯(lián)劑，制備羧甲基殼聚糖凝膠微球，通過檸檬酸在加熱的狀態(tài)原位還原硝酸銀生成納米銀單質(zhì)，制備含納米銀的羧甲基殼聚糖微球。

(1)使用GDL/碳酸鈣體系，在硬脂酸鎂作為封端劑的條件下可形成離子交聯(lián)的微球，微球不水溶，可在乙醇等有機溶劑中均勻分散。

(2)使用檸檬酸/碳酸鈣體系，在硬脂酸鎂的存在下微球的顆粒較GDL/碳酸鈣體系下更大，檸檬酸既可以作為羧甲基殼聚糖的微球的交聯(lián)劑，同時對硝酸銀具有還原作用，生成寬分布的納米態(tài)銀單質(zhì)，使用檸檬酸/硝酸銀/碳酸鈣還原交聯(lián)體系可以制備出含銀的羧甲基殼聚糖微球，這其中，水相與油相的比例、轉(zhuǎn)速、交聯(lián)劑的用量對微球的形態(tài)都有重要的影響。