貫筋藤多糖的提取及其單糖組分分析

施婭楠，謝文祥，陶亮，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

貫筋藤（Dregea sinensis Hemsl.）[1]，為蘿藦科（Asclepiadaceae） 南山藤屬（Dregea E.Mey.，nom.cons.）植物，俗稱“奶漿藤”，生長(zhǎng)于海拔2 000 m～3 000 m 山地森林中或山地林谷溝旁，主產(chǎn)于云南巍山、劍川、昆明，貴州等地，資源豐富，當(dāng)?shù)匕傩绽蔑L(fēng)干貫筋藤水溶液作為凝乳劑生產(chǎn)民族食品乳餅，乳扇。黃艾祥等[2-6]對(duì)貫筋藤天然植物凝乳劑、蛋白酶，貫筋藤花營(yíng)養(yǎng)成分、安全性進(jìn)行了系列研究，中科院昆明植物研究所對(duì)貫筋藤中的小分子活性物質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定[7-9]，關(guān)于貫筋藤多糖的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

根據(jù)《云南植物志》記載“貫筋藤全株藥用，防齲齒，止瀉抑菌，耐缺氧抗疲勞，對(duì)癲癇疾患有較好的療效”，是一種重要的藥用和食用資源[10]，目前大量的貫筋藤莖桿提取凝乳劑后直接丟棄，造成大量資源浪費(fèi)，如莖稈中多糖，有機(jī)酸，萜類和黃酮等活性成分[8-9]。隨著多種真菌多糖、植物多糖被成功的開(kāi)發(fā)和利用，如食用菇多糖、茯苓多糖、海藻多糖、鐵皮石斛多糖、金針菇多糖等[11-16]，多糖大量的活性功能也相繼報(bào)道，如調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗炎、抗氧化、降血糖及抗菌等有益生理活性以及極低的毒副作用[17-18]。本研究以貫筋藤的高值化利用出發(fā)，進(jìn)一步提取多糖，并采用乙酸酐乙?；苌▽?duì)貫筋藤莖桿多糖中單糖組份進(jìn)行定性研究，為云南地方資源的開(kāi)發(fā)以及貫筋藤進(jìn)一步活性功能的挖掘提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貫筋藤鮮莖：采自云南大理州劍川縣，海拔2 000m～3 000 m 山地森林或灌木叢；標(biāo)準(zhǔn)單糖：Merck 公司；Beyotime 蛋白定量試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975c 氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 公司；SpectraMax M5x 酶 標(biāo) 儀 ：Molecular Devices 公 司 ；ProUV-1700 紫外可見(jiàn)光譜儀：日本島津公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；TDL-5-A 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；78-2 型磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；Megafug e1.0R 型高速冷凍離心機(jī)：丹麥Heto 公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 貫筋藤多糖樣品制備

貫筋藤莖稈取洗凈去雜物，敲碎浸提，過(guò)濾后減壓濃縮至原體積的四分之一，加入80%乙醇，醇沉24 h 后離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3 次，后水浴加熱，除去乙醇，弱堿性樹(shù)脂DEAE 纖維素脫色，三氯乙酸脫蛋白，透析、離心，最后用丙酮洗滌2 次，真空冷凍干燥得貫筋藤多糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置貫筋藤鮮莖料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]，浸提溫度（50、60、70、80、90℃），浸提時(shí)間（20、40、60、80、100 min），以多糖得率為指標(biāo)，研究各因素變量對(duì)貫筋藤莖桿中多糖提取率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）為考慮因素，以貫筋藤粗多糖得率為參考指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 貫筋藤多糖提取工藝的正交試驗(yàn)方案Table 1 Factor and levels for orthogonal experiment on extraction of polysaccharide from Dregea sinensis Hemsl.

2 檢測(cè)指標(biāo)

2.1 貫筋藤理化分析

貫筋藤多糖得率/%=（多糖干品質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100；苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[19]；硫酸基含量采用硫酸鋇比濁法[20]；貫筋藤蛋白含量測(cè)定采用二氨基二甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白分析試劑盒。

2.2 定性分析

采用溶解試驗(yàn)、茚三酮反應(yīng)和碘-碘化鉀反應(yīng)[21]。

2.3 貫筋藤多糖中單糖組分的氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

2.3.1 多糖的水解

稱取貫筋藤多糖15 mg，加入3 mol/L 三氟乙酸10 mL，于120℃水解4 h，取出冷卻后，減壓蒸干，放置于干燥器中備用。

2.3.2 乙酰化衍生物的制備

取星蟲(chóng)多糖水解后的干燥品8 mg，加入10 mg 鹽酸羥胺，0.5 mL 吡啶，于90℃油浴中反應(yīng)30 min。加入0.5 mL 乙酸酐，在90℃油浴乙?；?0 min，反應(yīng)產(chǎn)物減壓蒸干。用1 mL 的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。取上層吡啶層進(jìn)行GC-MS 分析。

2.3.3 單糖對(duì)照品衍生物的制備

同2.3.2中的方法制備對(duì)照品鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖制備單糖乙酰化衍生物各1.0 mL。

2.3.4 空白溶液的制備

操作步驟同2.3.3，試管中不加多糖樣品。

2.3.5 色譜條件

按照劉玉明等[22]的GC-MS 參數(shù)并做適當(dāng)修正：DB-5MS UI 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣；汽化室溫度250℃；程序升溫，起始溫度100℃，以5℃/min 升至200℃，保持1 min，再以10℃/min 升至250℃，保持5 min；載氣流速1.0 mL/min，分流比20∶1，進(jìn)樣量1 μL；接口溫度280℃；電離方式為EI；電子轟擊能量70 eV；溶劑延長(zhǎng)時(shí)間5 min；全掃描范圍：50 m/z～800 m/z，選擇離子掃描。根據(jù)峰面積歸一化得單糖組成的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在上述色譜條件下，先將標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合液進(jìn)樣，記錄色譜峰的保留時(shí)間、衍生物的峰位置，供試品溶液和空白溶液隨后進(jìn)樣。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同浸提溫度下貫筋藤多糖的得率

浸提溫度對(duì)貫筋藤多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 浸提溫度對(duì)貫筋藤多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖1可知，貫筋藤多糖最適提取溫度應(yīng)控制在70℃，得率為6.91%，適宜的溫度有利于分子熱運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)傳質(zhì)從而提高得率，溫度在80℃～90℃區(qū)間得率緩慢下降，多糖可溶物在溫度過(guò)高的情況下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致溶解性降低。

3.2 不同浸提時(shí)間下貫筋藤多糖的得率

浸提時(shí)間對(duì)貫筋藤多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)貫筋藤多糖得率的影響Fig.2 Effect of time on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖2可知，浸提60 min 后，得率呈下降趨勢(shì)，貫筋藤粗多糖在提取液中趨于飽和，體系黏度變大，因而未溶出的多糖的傳質(zhì)過(guò)程受到阻礙，溶出速率減慢；其次某些五碳環(huán)或六碳環(huán)因處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)變單糖、寡糖或低聚糖裂解而溶于乙醇的，在醇沉過(guò)程中有所損失，因此選擇最適提取時(shí)間為60 min，多糖得率為7.00%。

3.3 不同料液比下貫筋藤多糖的得率

浸提料液比對(duì)貫筋藤多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides from Dregea sinensis Hemsl.

由圖3可知，在提取溫度70℃、提取時(shí)間60 min、料液比1∶20（g/mL）時(shí)，貫筋藤多糖的含量達(dá)7.03%，雖然未經(jīng)過(guò)其他輔助提取，與其他物理單次提取藤莖類植物多糖文獻(xiàn)報(bào)道類似。原因是溶劑體積小時(shí)，多糖溶解不充分，隨著提取溶劑的增加，溶劑與莖稈的接觸面積增大，加快了多糖的溶出，其次多糖充分溶脹，也有利于多糖的溶出，但溶劑體積過(guò)大，使后續(xù)中的濃縮時(shí)間增加，必然使多糖在濃縮過(guò)程中有較多損失，反而使多糖得率下降。

3.4 貫筋藤莖中粗多糖提取最佳條件的確定

對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

由表2極差R 的大小順序可知，影響貫筋藤粗多糖得率的各因素主次關(guān)系為：浸提溫度〉料液比〉浸提時(shí)間，最佳提取工藝為A2B2C3，即浸提溫度75℃，料液比1∶25（g/mL），浸提時(shí)間60 min。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，進(jìn)行貫筋藤莖中粗多糖的提取試驗(yàn)過(guò)程中，料液比、浸提溫度對(duì)貫筋藤粗多糖的得率影響p 值分別為0.010 9，0.048 2，0.030 6，均達(dá)顯著水平（p〈0.05），說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信。在此優(yōu)化工藝條件下，重復(fù)試驗(yàn)3 次，測(cè)得均總多糖的含糖量為7.04%。

3.5 貫筋藤多糖的理化性質(zhì)

1）貫筋藤多糖脫色后呈灰白色粗粉狀，微甜澀味，具有植物清香和焦糖味，易溶于水，不溶于無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。貫筋藤多糖可能含有酚型化合物而顏色較深，濃縮液經(jīng)弱堿性纖維素樹(shù)脂脫色由棕色變?yōu)槲ⅫS的黏稠狀液體。2）碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，茚三酮反應(yīng)呈弱陽(yáng)性，說(shuō)明可能為非淀粉性多糖、含有少量的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)。

3.6 貫筋藤多糖的得率、總糖含量、硫酸基含量及貫筋藤蛋白含量

經(jīng)提取工藝優(yōu)化的貫筋藤多糖得率為7.04%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=8.442 3x+0.015 9（R2=0.939）計(jì)算出多糖的總糖含量為16.7%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=4.099 1x+0.009 1（R2=0.951）計(jì)算出多糖的硫酸基含量為0.17%。硫酸多糖是多糖分子鏈中單糖分子的部分羥基被硫酸基取代而形成的一類多功能活性物質(zhì)，研究表明，多糖的許多生物活性功能與硫酸基含量（糖基所帶硫酸基的個(gè)數(shù)）有直接關(guān)系[23]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出貫筋藤莖稈的蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.652 1x+0.133 4（R2=0.995），蛋白濃度為7.243 mg/mL。

3.7 貫筋藤多糖的單糖組成

多糖是由10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起，具有多個(gè)極性基團(tuán)，不能直接揮發(fā)的大分子物質(zhì)，因此進(jìn)行氣相色譜分析時(shí)需將大分子多糖降解為具有易揮發(fā)，對(duì)熱穩(wěn)定的單糖或寡糖衍生物，本研究所采用的鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙?；苌苡行Э朔捎谔堑漠悩?gòu)體產(chǎn)生而造成的多峰現(xiàn)象，每種單糖都能獲得單一的色譜峰，利于進(jìn)行氣相色譜的定性分析，貫筋藤多糖乙?；苌a(chǎn)物的GC-MS 圖譜見(jiàn)圖4。

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和貫筋藤多糖各峰的出峰時(shí)間、峰面積見(jiàn)表3。

圖4 貫筋藤多糖水解物色譜圖Fig.4 Chromatogram of polysaccharide hydrolysate from Dregea sinensis Hemsl.

表3 貫筋藤多糖色譜信息Table 3 The information of chromatography in polysaccharide of Dregea sinensis Hemsl.

7個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的順序?yàn)槭罄钐牵?1.339 min；巖藻糖：12.509 min；阿拉伯糖：14.569 min；木糖：15.000 min；甘露糖：15.498 min；葡萄糖：16.815 min；半乳糖：19.998 min。通過(guò)與單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和離子碎片確定貫筋藤多糖由巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，果糖未檢出，其中葡萄糖和半乳糖摩爾百分含量達(dá)到90%以上，說(shuō)明貫筋藤多糖主要是由葡萄糖和半乳糖組成，由表3可知，其百分含量分別為葡萄糖80.3 %、半乳糖11.7 %、甘露糖3.98 %、阿拉伯糖3.69%、巖藻糖0.349%。

4 討論

采用水提醇沉法提取多糖存在一個(gè)缺陷，部分分子量較小的多糖會(huì)保留在上清中，而使多糖的測(cè)定結(jié)果偏低。多糖的提取方法還有酸提法、堿提法、超聲輔助法、凍融輔助法等[24]，低溫低壓提取、增壓提取及超臨界流體萃取法[25]。孫曉雪等[26]對(duì)比了傳統(tǒng)的Sevag法，三氯乙酸法和胰蛋白酶法脫蛋白對(duì)多糖損失率的影響，得出酶法的脫蛋白率最高和多糖損失率最低，在忽略成本的條件下，利于多糖后續(xù)的分離純化，其中多糖中蛋白質(zhì)的含量可采用考馬斯亮藍(lán)染色法。除單糖組成外，官能團(tuán)的差異、分子量的大小均能影響多糖的生理活性，對(duì)單糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化后研究其構(gòu)效關(guān)系，可采用紅外光譜，通過(guò)檢測(cè)特征峰、峰寬、峰距離推測(cè)分子內(nèi)和分子間的氫鍵、糖苷鍵、官能團(tuán)的情況，掃描電鏡、原子力顯微鏡等表征待測(cè)多糖結(jié)構(gòu)，并結(jié)合體外體內(nèi)抗氧化、降血脂、降血糖等活性[27]。董竹平等[28]認(rèn)為多糖的三螺旋螺旋結(jié)構(gòu)與其生理活性有關(guān)。Maeda 等[29]發(fā)現(xiàn)具有三螺旋結(jié)構(gòu)的 β-（1，3）葡聚糖比不具有三螺旋結(jié)構(gòu)的該葡聚糖具有更強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。

5 結(jié)論

貫筋藤多糖脫色后呈灰白色粗粉狀，微甜澀味，具有植物清香和焦糖味，屬于非淀粉性多糖，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、巖藻糖5種單糖組成，葡萄糖和半乳糖是貫筋藤多糖的主要成分，多糖提取工藝為料液比為1∶25（g/mL），浸提溫度75℃，浸提時(shí)間60 min，多糖得率7.04%，總糖含量為16.7%。研究為貫筋藤植物的開(kāi)發(fā)及綜合高效利用提供科學(xué)依據(jù)。