鞘內(nèi)保殘重建術(shù)與牽張保殘重建術(shù)對(duì)兔前交叉韌帶殘端成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響

舒莉，柴浩，巨嘯晨，張磊

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，烏魯木齊830002；2武警兵團(tuán)總隊(duì)醫(yī)院)

前交叉韌帶(ACL)損傷臨床發(fā)病率高，是骨科常見(jiàn)病。2009年美國(guó)普通人群ACL損傷率為35/100 000[1]，運(yùn)動(dòng)員高達(dá)60/100 000。我國(guó)雖無(wú)具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，但隨著運(yùn)動(dòng)事業(yè)和交通業(yè)的發(fā)展，ACL損傷發(fā)病率正逐年提高。ACL斷裂后脛骨殘端常長(zhǎng)期粘連在后交叉韌帶上。有研究認(rèn)為，殘端內(nèi)殘存的成纖維細(xì)胞能夠加速移植腱的韌帶化[2]，因而保留殘端(保殘)重建ACL成為近年運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前臨床常用的保殘重建ACL的術(shù)式主要為"殘端鞘內(nèi)重建"與"牽張保殘重建"，然而這兩種保殘重建ACL的術(shù)式是否存在療效差異，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。2017年12月～2018年6月，本研究建立了殘端鞘內(nèi)保殘重建ACL、牽張保殘重建ACL動(dòng)物模型，觀察兩種不同保殘重建術(shù)對(duì)ACL殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 雄性新西蘭大白兔43只，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，普通級(jí)、封閉群。舒泰(法國(guó)維克公司)，速眠新Ⅱ(吉林圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司)，增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原(Ki-67)試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、撈片機(jī)、烤片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，恒溫箱(北京永光明醫(yī)療器械有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 動(dòng)物分組及ACL重建 將43只(86膝)新西蘭大白兔隨機(jī)分為A組3只、B組8只、C組16只、D組16只。A組不予處理，B組單純切斷雙側(cè)ACL(16膝)，C、D組均為切斷后急性期右后肢ACL重建(16膝)。C組給予殘端鞘內(nèi)重建，動(dòng)物稱(chēng)質(zhì)量后給予舒泰7 mg/kg+速眠新Ⅱ 0.15 mL/kg大腿根部肌注，麻醉成功后，備皮、消毒鋪巾。切取同側(cè)跟腱中間1/3為移植腱，長(zhǎng)約4 cm，直徑2 mm。取髕旁?xún)?nèi)側(cè)入路，將髕骨向外脫位，在股骨附著處切斷ACL，保留滑膜組織。用直徑2 mm克氏針自股骨原ACL止點(diǎn)印跡處鉆取股骨隧道。分離ACL脛骨殘端成圓筒狀結(jié)構(gòu)；細(xì)導(dǎo)針于殘端印跡中心通過(guò)，用直徑2 mm空心鉆沿導(dǎo)針?lè)聪驍U(kuò)孔，將移植腱經(jīng)脛骨隧道從殘端中心穿過(guò)，使殘端像“袖套”包繞移植物。固定移植腱脛骨端和股骨端。生理鹽水沖洗切口，逐層縫合。D組給予牽張保殘重建術(shù)，麻醉、手術(shù)入路、移植腱取材、股骨隧道制法同C組。在ACL殘端縫1針作為牽引線(xiàn)，脛骨隧道內(nèi)口定位在ACL足跡中心偏后1 mm處，鉆取脛骨隧道，移植腱由脛骨隧道外口向關(guān)節(jié)內(nèi)穿入，先固定移植腱脛骨端，伸直位將ACL殘端與移植腱縫合，再固定股骨端，殘端引線(xiàn)從股骨骨道中穿過(guò)，將殘端盡量向股骨隧道牽拉，給予殘端一定張力。

1.3 標(biāo)本采集及切片制作 A組作為正常對(duì)照選取兩側(cè)后肢正常ACL(脛骨端4 mm)。術(shù)后3、6周B組分別取4只過(guò)量麻醉處死，C、D組各取8只過(guò)量麻醉處死。B、C、D組ACL殘端用10%多聚甲醛固定，脫水，透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚的移植物切片。

1.4 殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用HE染色法。石蠟切片脫蠟，行梯度乙醇脫水，細(xì)胞核染色，分化，脫水，透明，封片。成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)：每張切片取5個(gè)高倍視野(10×40)，用鼠標(biāo)標(biāo)記成纖維細(xì)胞，IPP 圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值。

1.5 殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化EnVision二步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟同HE染色，水化，PBS沖洗，抗原修復(fù)，滴加一抗，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。普通顯微鏡下，Ki-67蛋白陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，呈黃褐色染色。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其平均值為Ki-67蛋白陽(yáng)性率。

1.6 殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法。按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Proteinase K工作液處理標(biāo)本,TdT和DIG-dUTP反應(yīng),加封閉液,抗體稀釋,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。普通顯微鏡下，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組HE染色觀察和成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 A組ACL表面被滑膜組織覆蓋，成纖維細(xì)胞數(shù)量不多，細(xì)胞核以橢圓形為主，大多分布于膠原纖維中，呈波浪狀有規(guī)則排列。術(shù)后3周，B、C、D組殘端細(xì)胞數(shù)量增加，排列紊亂，無(wú)規(guī)律，細(xì)胞核多為梭形。術(shù)后3、6周，B、C、D組ACL脛骨殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量均多于A組(P均<0.05)，B、C、D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后6周，B、C、D組成纖維細(xì)胞數(shù)量較術(shù)后3周減少，但仍高于A組(P均<0.05)，排列仍然無(wú)序。術(shù)后3、6周，B、C、D組ACL脛骨殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)>比較(個(gè)，

注：與同時(shí)點(diǎn)A組比較，aP<0.05。

2.2 各組殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖、凋亡比較 術(shù)后3、6周，B、C、D組Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、凋亡率高于A組(P均<0.05)；B、C、D組殘端成纖維細(xì)胞內(nèi)Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表2 兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、凋亡率

注：與A組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05。

3 討論

Lee等[3～5]報(bào)道了"殘端鞘內(nèi)重建"和"牽張保殘重建"兩種保殘重建ACL韌帶的手術(shù)方式，并逐漸被臨床熟知。殘端鞘內(nèi)重建的特點(diǎn)是殘端形成袖套狀結(jié)構(gòu)，移植物從中穿過(guò)，殘端將移植物充分包裹。牽張保殘重建的關(guān)鍵是為了恢復(fù)殘端的張力，使移植物與殘端相互包繞，防止殘端回縮形成獨(dú)眼癥。然而哪種術(shù)式促進(jìn)移植腱愈合效果更好目前尚不明確。Jung等[6]在2011年對(duì)兩種保殘手術(shù)療效進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩組國(guó)際膝部文件委員會(huì)主觀膝部評(píng)估分級(jí)、骨性關(guān)節(jié)炎評(píng)分及關(guān)節(jié)穩(wěn)定測(cè)量?jī)x側(cè)-側(cè)差值比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但該研究只比較了膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性及功能，并未比較兩組移植腱愈合情況。

本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立殘端鞘內(nèi)重建和牽張保殘兩種手術(shù)模型，并觀察兩種不同保殘重建術(shù)后ACL殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞的增殖及凋亡情況，希望從組織學(xué)層面論證兩種保殘術(shù)式之間的差異。Ki-67被認(rèn)為是增殖細(xì)胞的標(biāo)志性抗原[7]，與細(xì)胞有絲分裂密切聯(lián)系，對(duì)蛋白酶十分敏感，半衰期很短，是反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)。其準(zhǔn)確性明顯高于增殖細(xì)胞核抗原指數(shù)和DNA倍增含量,已被廣泛用于多種細(xì)胞增殖的檢測(cè)[8]，可以較好地反映成纖維細(xì)胞的增殖情況[9]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在不同基因調(diào)控下的程序性死亡[10]，TUNEL法將分子生物學(xué)與組織學(xué)緊密結(jié)合，可對(duì)已經(jīng)凋亡的細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行標(biāo)記，能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡情況。TUNEL法在細(xì)胞DNA斷裂的凋亡早期就可顯示出細(xì)胞內(nèi)的凋亡小體，比電鏡檢查能更早發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。目前隨著運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，證實(shí)細(xì)胞凋亡與組織退變密切相關(guān)[11]。

保殘的初衷是希望殘端內(nèi)殘存的細(xì)胞、血管能夠充當(dāng)細(xì)胞源泉的角色并與移植腱充分融合。殘端能夠按照預(yù)期完成韌帶化任務(wù)的前提必須是自身具備愈合能力。Nguyen等[12]對(duì)ACL完全斷裂患者的ACL殘端進(jìn)行活檢，發(fā)現(xiàn)ACL斷裂后，殘端內(nèi)血管、細(xì)胞增殖明顯，其中以成纖維細(xì)胞為主，展現(xiàn)出了一定的細(xì)胞增殖活性和自愈能力。移植肌腱的重塑需經(jīng)歷缺血壞死、血管和滑膜長(zhǎng)入、細(xì)胞(成纖維細(xì)胞為主)再生、膠原重排和重塑等過(guò)程。如果ACL殘端內(nèi)的成纖維細(xì)胞能夠遷移至移植腱內(nèi)，或許能夠加速移植腱的成熟。因此，本研究探討兩種保殘重建術(shù)式對(duì)ACL殘端成纖維細(xì)胞數(shù)量及生物活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3、6周殘端B、C、D組ACL殘端內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，以成纖維細(xì)胞為主，與以上研究報(bào)道一致。B、C、D組殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量迅速增多，估計(jì)是殘端斷裂后炎癥的刺激，加之殘端有一定的自愈傾向。但三組成纖維細(xì)胞增殖、凋亡在術(shù)后3、6周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因可能為：①牽張保殘重建ACL雖然給予殘端一定機(jī)械張力，但這種張力既未促進(jìn)成纖維細(xì)胞的DNA合成，使增殖增加，也未減少其凋亡。雖然成纖維細(xì)胞對(duì)外源性張力的刺激極為敏感，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械張力不但能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和生物學(xué)活性，也能減少成纖維細(xì)胞的凋亡[13]。牽張保殘重建ACL術(shù)的目的之一也是給予ACL殘端一定的張力，以保持ACL實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞的活性。然而目前牽張應(yīng)力對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性影響的研究還處于起步階段，仍有大量問(wèn)題未解決，牽引力的大小、作用方式、作用周期都會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖造成不同的影響。張曉東等[14]研究不同大小應(yīng)力對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，6%、12%牽張力能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，而18%牽張力卻抑制成纖維細(xì)胞的增殖?？梢?jiàn)在一定范圍內(nèi)的牽張力能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并不是所有牽張力都具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。另有研究顯示，牽張力的頻率、次數(shù)、周期性都會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的影響。牽張保殘重建ACL雖然將殘端牽引入股骨隧道并縫合在移植物上，但所產(chǎn)生的牽張力可能并未達(dá)到促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及減少其凋亡的作用[15]。②術(shù)后膝關(guān)節(jié)未制動(dòng)，交叉韌帶殘端同移植物縫合后，韌帶殘端會(huì)隨移植物的運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)，移植物在術(shù)后膝關(guān)節(jié)屈伸過(guò)程中張力不斷變化，因而并不能保證殘端始終保持合適的張力。綜上可以看出，兩種手術(shù)方式術(shù)后殘端成纖維細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是“殘端鞘內(nèi)重建”還是“牽張保殘重建”，ACL殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量、增殖率和凋亡率都隨時(shí)間變化而變化。即細(xì)胞數(shù)量、增殖率在術(shù)后早期增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低；而凋亡率則隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。原因可能為在ACL斷裂后，斷端的炎癥反應(yīng)有一定的自愈傾向；但隨著炎癥的吸收及ACL殘端的廢用，韌帶內(nèi)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸降低。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3、6周ACL殘端成纖維細(xì)胞增殖、凋亡均高于正常ACL，其具體原因仍不得而知，希望通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

綜上所述，“殘端鞘內(nèi)重建”和“牽張保殘重建”兩種保殘術(shù)式殘端內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖和凋亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，牽張保殘重建ACL并未體現(xiàn)出更強(qiáng)的保持殘端內(nèi)細(xì)胞活性作用。本研究尚存在不足之處：①動(dòng)物造模是在切開(kāi)關(guān)節(jié)囊的情況下進(jìn)行，手術(shù)創(chuàng)傷不可避免地要比關(guān)節(jié)鏡下微創(chuàng)手術(shù)大，關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)和愈合過(guò)程可能也與臨床存在一定差異。②實(shí)驗(yàn)對(duì)象是新西蘭大白兔，因?yàn)榉N屬差異，其組織學(xué)變化可能與人類(lèi)存在一定差異。